I molekylärbiologi kan bra buffertval och förberedelse för olika DNA-isoleringssteg vara skillnaden mellan att gå vidare till proteinuttryck eller öppna ett annat maxi-prep-kit för att starta över. Trots sin avgörande betydelse är buffertrecept ofta just det - recept skrivna utan förklaring eller motivering för de olika komponenterna. En sådan buffert är glukos-tris-EDTA eller GTE-buffert.
Vad används GTE för?
GTE används för att återsuspendera bakteriecellpellets innan celler lyseras (bryts upp) och plasmid-DNA skördas inuti. Lysozym, som mjukar cellmembranen, tillsätts ofta tillsammans med GTE-bufferten. Att uppnå en homogen suspension av hela celler under detta steg så att den därefter tillsatta lyslösningen kan komma till alla celler är nyckeln till att få bra DNA-utbyten. GTE är utformat för att göra detta samtidigt som det ger en stabil miljö för DNA.
Glukos för osmolaritet
50 mM (millimolärt) glukos socker tillsätts till GTE-bufferten för att bibehålla osmolaritet där den lösta koncentrationen utanför cellerna ligger nära den inuti cellerna. Detta förhindrar för tidig celllys, vilket kan orsaka lägre DNA-utbyten på grund av aggregering och nedbrytning. De andra komponenterna i bufferten bidrar också till lösningens osmolaritet, men glukos, att vara en icke-elektrolyt, är ett bra val eftersom det inte stör lösningens buffert egenskaper.
Tris för pH-stabilitet
Tris är det korta namnet på tris (hydroximetyl) aminometan, vilket är en mycket vanlig pH-buffert. I fallet med GTE-buffert tillsätts syrasaltet (Tris-HCl) till bufferten i en koncentration av 25 mM. Detta håller lösningens pH vid en nästan fysiologisk 8,0, ett idealiskt pH för att förhindra syrahydrolys (nedbrytning) av plasmid-DNA och oönskade sidoreaktioner av de andra cellkomponenterna.
EDTA förhindrar DNA-nedbrytning
EDTA, eller etylendiamintetraättiksyra, fångar upp eller "kelaterar" metalljoner ur lösningen, vilket förhindrar dem från att delta i oönskade sidoreaktioner. I GTE-buffert tillsätts EDTA vid 10 mM. Dess primära syfte är i bufferten att avrunda fritt zink, magnesium och kalcium, vilket förhindrar DNA-nedbrytning genom vissa vägar som kräver dessa metaller.
Några viktiga tips
Håll din GTE-buffert kall och gör den i små mängder för att förhindra tillväxt av oavsiktliga bakterier i den. Socker och det kontrollerade pH-värdet är ett bra tillväxtmedium. Använd alltid renat vatten. Kranvatten kan ha ett överskott av metalljoner från rören, vilket kan överväldiga EDTA: s förmåga att fånga. Om du misstänker förekomsten av störande RNA i ditt prov, lägg till RNase A med 100 mikrogram per milliliter till din GTE-buffert för att eliminera problemet.