DNA-sekvensering: definition, metoder, exempel

Nukleotider är livets kemiska byggstenar och finns i DNA hos levande organismer. Varje nukleotid består av ett socker, fosfat och a kvävehaltig bas: adenin (A), tymin (T), cytosin (C) och guanin (G). Den specifika ordningen för dessa nukleotidbaser bestämmer vilka proteiner, enzymer och molekyler som kommer att syntetiseras av cellen.

Att bestämma ordningen eller sekvensen av nukleotider är viktigt för studien av mutationer, evolution, sjukdomsprogression, genetisk testning, kriminalteknisk undersökning och medicin.

Genomik är studiet av DNA, gener, geninteraktioner och miljöpåverkan på gener. Hemligheten att avslöja genernas komplexa inre funktion är att kunna identifiera deras struktur och placering på kromosomer.

Ritningen av levande organismer bestäms av ordningen (eller sekvensen) av nukleinsyrabaspar i DNA. När DNA replikerar parar adenin sig med tymin och cytosin med guanin; felaktiga par beaktas mutationer.

Sedan den dubbla spiralen deoxiribonukleinsyra (DNA) -molekylen konceptualiserades 1953, dramatiska förbättringar har gjorts inom genomik och storskalig DNA-sekvensering. Forskare arbetar flitigt för att tillämpa denna nya kunskap på individualiserad behandling av sjukdomar.

Samtidigt tillåter pågående diskussioner forskare att hålla sig före de etiska konsekvenserna av sådan snabbt exploderande teknik.

DNA-sekvensering är processen att upptäcka sekvensen för olika nukleotidbaser i DNA-fragment. Helgen-sekvensering möjliggör jämförelser av kromosomer och genom som finns i samma och olika arter.

Att kartlägga kromosomer är användbart för vetenskaplig forskning. Analys av mekanismer och struktur för gener, alleler och kromosommutationer i DNA-molekyler antyder nya sätt att behandla genetiska störningar och stoppa till exempel cancertumörtillväxt.

Frederick Sangers DNA-sekvenseringsmetoder avancerade kraftigt genomområdet med början på 1970-talet. Sanger kände sig redo att ta itu med DNA-sekvensering efter framgångsrik sekvensering av RNA när han studerade insulin. Sanger var inte den första forskaren som dabblade i DNA-sekvensering. Hans smarta DNA-sekvenseringsmetoder - utvecklade tillsammans med kollegorna Berg och Gilbert - fick dock Nobelpriset 1980.

Sanger kände till det potentiella värdet av sitt arbete och samarbetade ofta med andra forskare som delade hans intressen för DNA, molekylärbiologi och biovetenskap.

Även om det var långsamt och dyrt i jämförelse med dagens sekvenseringstekniker hyllades Sangers DNA-sekvenseringsmetoder vid den tiden. Efter försök och fel hittade Sanger det hemliga biokemiska ”receptet” för att separera DNA-strängar, skapa mer DNA och identifiera ordningen på nukleotider i ett genom.

Högkvalitativa material kan enkelt köpas för användning i laboratoriestudier:

• DNA-polymeras är det enzym som behövs för att skapa DNA.
• DNA-primer berättar enzymet var man ska börja arbeta med DNA-strängen.
• dNTP: er är organiska molekyler som består av deoxiribossocker och nukleosidtrifosfater - dATP, dGTP, dCTP och dTTP - som samlar proteiner
• Kedjeterminatorer är färgfärgade nukleotider, även kallade terminatornukleotider för varje bas - A, T, C och G.

Sanger fick reda på hur man kan skära DNA i små segment med hjälp av enzymet DNA-polymeras.

Han gjorde sedan mer DNA från en mall och infogade radioaktiva spårämnen i det nya DNA för att avgränsa delar av de separerade trådarna. Han insåg också att enzymet behövde en primer som kunde bindas till en specifik fläck på mallsträngen. 1981 gjorde Sanger igen historia genom att räkna ut genomet av mitokondriellt DNA: s 16 000 baspar.

Temperaturen måste justeras noggrant under hela sekvenseringsprocessen. Först tillsätts kemikalier i ett rör och värms upp för att riva upp (denaturera) dubbelsträngade DNA-molekyl. Därefter kyls temperaturen så att grundfärgen kan bindas.

Därefter höjs temperaturen för att uppmuntra optimal DNA-polymeras (enzym) aktivitet.

Polymeras använder vanligtvis de tillgängliga nukleotiderna som är tillgängliga, vilka tillsätts i en högre koncentration. När polymeras kommer till en "kedjeterminerande" färgbunden nukleotid, stoppas polymeraset och kedjan slutar där, vilket förklarar varför de färgade nukleotiderna kallas "kedjeterminerande" eller "Terminatorer."

Processen fortsätter många, många gånger. Så småningom har den färgbundna nukleotiden placerats vid varje enskild position i DNA-sekvensen. Gelelektrofores och datorprogram kan sedan identifiera färgfärgerna på var och en av DNA-trådarna och räkna ut hela DNA-sekvensen baserat på färgämnet, färgämnets position och längden på trådar.

Hög genomströmning sekvensering - allmänt kallad nästa generations sekvensering - använder nya framsteg och tekniker för att sekvensera nukleotidbaser snabbare och billigare än någonsin tidigare. En DNA-sekvenseringsmaskin kan enkelt hantera storskaliga sträckor av DNA. Faktum är att hela genomet kan göras på några timmar, istället för år med Sangers sekvenseringstekniker.

Nästa generations sekvenseringsmetoder kan hantera högvolym-DNA-analys utan det extra steget med amplifiering eller kloning för att få tillräckligt med DNA för sekvensering. DNA-sekvenseringsmaskiner kör flera sekvenseringsreaktioner samtidigt, vilket är billigare och snabbare.

I huvudsak kör den nya DNA-sekvenseringsteknologin hundratals Sanger-reaktioner på ett litet, lättläst mikrochip som sedan körs genom ett datorprogram som sammanställer sekvensen.

Tekniken läser kortare DNA-fragment, men den är fortfarande snabbare och effektivare än Sangers sekvenseringsmetoder, så även stora projekt kan snabbt slutföras.

De Human Genome Project, avslutad 2003, är en av de mest kända sekvenseringsstudier som hittills gjorts. Enligt en artikel från 2018 i Science News, består det mänskliga genomet av ungefär 46 831 gener, vilket var en formidabel utmaning att ordna. Toppforskare från hela världen tillbringade nästan 10 år samarbete och konsultation. Leds av National Human Genome Research

Institutet kartlade projektet framgångsrikt det mänskliga genomet med hjälp av ett sammansatt prov som tagits från anonyma blodgivare.

Human Genome Project förlitar sig på bakteriell artificiell kromosom (BAC-baserad) sekvenseringsmetod för att kartlägga baspar. Tekniken använde bakterier för att klona DNA-fragment, vilket resulterade i stora mängder DNA för sekvensering. Klonerna reducerades sedan i storlek, placerades i en sekvenseringsmaskin och monterades i sträckor som representerade humant DNA.

Nya upptäckter inom genomics förändrar djupgående tillvägagångssätt för förebyggande, upptäckt och behandling av sjukdomar. Regeringen har förbundit sig miljarder dollar till DNA-forskning. Brottsbekämpning är beroende av DNA-analys för att lösa ärenden. DNA-testkit kan köpas för hemmabruk för att undersöka anor och identifiera genvarianter som kan utgöra hälsorisker:

• Genomisk analys innebär att man jämför och kontrasterar genom-sekvenser för många olika arter i livets domäner och riken. DNA-sekvensering kan avslöja genetiska mönster som belyser när vissa sekvenser introducerades evolutionärt. Anor och migration kan spåras via DNA-analys och jämföras med historiska register.

• Framsteg inom medicin sker i en exponentiell takt eftersom praktiskt taget alla mänskliga sjukdomar har en genetisk komponent. DNA-sekvensering hjälper forskare och läkare att förstå hur flera gener interagerar med varandra och miljön. Att snabbt sekvensera DNA från en ny mikrob som orsakar sjukdomsutbrott kan hjälpa till att identifiera effektiva läkemedel och vacciner innan problemet blir ett allvarligt folkhälsoproblem. Genvarianter i cancerceller och tumörer kan sekvenseras och användas för att utveckla individualiserad genterapi.

• Kriminalteknik ansökningar har använts för att hjälpa brottsbekämpning att knäcka tusentals svåra fall sedan slutet av 1980-talet, enligt National Institute of Justice. Brottsplatsbevis kan innehålla prover av DNA från ben, hår eller kroppsvävnad som kan jämföras med en misstänktas DNA-profil för att avgöra skuld eller oskuld. Polymeraskedjereaktionen (PCR) är en vanligt använd metod för att göra kopior av DNA från spårbevis före sekvensering.

• Sekvensering av nyligen upptäckta arter kan hjälpa till att identifiera vilka andra arter som är närmast besläktade och avslöja information om evolutionen. Taxonomer använder DNA-streckkoder för att klassificera organismer. Enligt University of Georgia i maj 2018 finns det uppskattningsvis 303 arter av däggdjur som ännu inte har upptäckts.

• Genetisk testning av sjukdomar leta efter muterade genvarianter. De flesta är enstaka nukleotidpolymorfismer (SNP), vilket innebär att endast en nukleotid i sekvensen ändras från den "normala" versionen. Miljöfaktorer och livsstil påverkar hur och om vissa gener uttrycks. Globala företag gör banbrytande ny generationens sekvenseringsteknologi tillgänglig för forskare runt om i världen som är intresserade av multigen-interaktioner och helgenomsekvensering.

• Släktforskning DNA-kit använda DNA-sekvenser i sin databas för att söka efter varianter i en individs gener. Satsen kräver ett salivprov eller kindpinne som skickas till ett kommersiellt laboratorium för analys. Förutom information om anor kan vissa kit identifiera enstaka nukleotidpolymorfismer (SNP) eller andra välkända genetiska varianter såsom BRCA1- och BRCA2-generna associerade med förhöjd risk för kvinnligt bröst och äggstockscancer.

Ny teknik kommer ofta med möjlighet till social nytta och skada; exempel inkluderar kärnkraftverk som inte fungerar och massförstörelsevapen. DNA-teknik medför också risker.

Känslomässiga bekymmer om DNA-sekvensering och genredigeringsverktyg som CRISPR inkluderar rädsla för att teknik kan underlätta mänsklig kloning eller leda till mutanta transgena djur som skapats av en skurk forskare.

Oftare har etiska frågor relaterade till DNA-sekvensering att göra med informerat samtycke. Enkel åtkomst till direkt-till-konsument-DNA-test innebär att konsumenter kanske inte helt förstår hur deras genetiska information kommer att användas, lagras och delas. Läkare kanske inte är känslomässigt redo att lära sig om sina defekta genvarianter och hälsorisker.

Tredjeparter som arbetsgivare och försäkringsbolag kan potentiellt diskriminera individer som har defekta gener som kan ge upphov till allvarliga medicinska problem.