Fördelarna med att använda klibbiga enzymer

Molekylär kloning är en vanlig bioteknikmetod som alla studenter och forskare bör känna till. Molekylär kloning med en typ av enzym som kallas ett restriktionsenzym för att skära humant DNA i fragment som sedan kan införas i plasmid-DNA i en bakteriecell. Restriktionsenzymer skär dubbeltrådat DNA på mitten. Beroende på restriktionsenzymet kan snittet resultera i antingen en klibbig eller en trubbig ände. Klibbiga ändar är mer användbara vid molekylär kloning eftersom de säkerställer att det humana DNA-fragmentet sätts in i plasmiden i rätt riktning. Ligeringsprocessen, eller sammansmältning av DNA-fragment, kräver mindre DNA när DNA har klibbiga ändar. Slutligen kan flera klibbiga ändrestriktionsenzymer producera samma klibbiga ände, även om varje enzym känner igen en annan restriktionssekvens. Detta ökar sannolikheten för att din DNA-region av intresse kan skäras ut av klibbiga enzymer.

Restriktionsenzymer är enzymer som skär igenkänner specifika sekvenser på dubbelsträngat DNA och skär DNA i hälften vid den sekvensen. Den igenkända sekvensen kallas restriktionsstället. Restriktionsenzymer kallas endonukleaser eftersom de skär dubbelsträngat DNA, vilket är hur DNA normalt finns, på platser som ligger mellan DNA-ändarna. Det finns mer än 90 olika restriktionsenzymer. Var och en känner igen en distinkt restriktionsplats. Restriktionsenzymer klyver sina respektive restriktionsställen 5 000 gånger mer effektivt än andra platser som de inte känner igen.

Restriktionsenzymer finns i två allmänna klasser. De skär antingen DNA i klibbiga ändar eller trubbiga ändar. En klibbig ände har en kort region av nukleotider, byggstenarna för DNA, som är oparade. Denna oparade region kallas ett överhäng. Överhänget sägs vara klibbigt eftersom det vill och kommer att para ihop med en annan klibbig ände som har kompletterande överhängssekvens. Klibbiga ändar är som förlorade tvillingar som vill krama varandra tätt när de möts. Å andra sidan är trubbiga ändar inte klibbiga eftersom alla nukleotiderna redan är parade mellan de två DNA-strängarna. Fördelen med klibbiga ändar är att ett fragment av humant DNA bara kan passa in i en bakteriell plasmid i en riktning. Däremot, om både det humana DNA: t och den bakteriella plasmiden har trubbiga ändar, kan det humana DNA: t införas från topp till svans eller svans mot huvud i plasmiden.

Även om DNA med stickändar har lättare att hitta varandra på grund av deras "klibbighet" kan varken klibbiga ändar eller trubbiga ändar smälta samman till en kontinuerlig bit DNA. Bildning av en kontinuerlig DNA-bit som är fullständigt kopplad kräver ett enzym som kallas ligas. Ligaser förbinder ryggraden i nukleotider vid de klibbiga eller trubbiga ändarna, vilket resulterar i en kontinuerlig kedja av nukleotider. Eftersom klibbiga ändar hittar varandra snabbare på grund av deras attraktion för varandra kräver ligeringsprocessen mindre humant DNA och mindre plasmid-DNA. De trubbiga ändarna av DNA och plasmider är mindre benägna att hitta varandra, och således kräver ligering av trubbiga ändar att mer DNA läggs i provröret.

Restriktionsställen finns i hela organismen, men är inte jämnt fördelade. I plasmider kan de konstrueras för att placeras bredvid varandra. Forskare som vill klippa ut ett fragment av humant DNA från det mänskliga genomet måste hitta restriktionsställen som är framför och bakom fragmentet. Förutom att se till att ett DNA-fragment införs i rätt riktning, kan olika klibbiga enzymer skapa samma klibbiga ände trots att de känner igen olika restriktionssekvenser. Till exempel har BamHI, BglII och Sau3A olika igenkänningssekvenser men producerar samma GATC-klibbiga ände. Detta ökar sannolikheten för att det kommer att finnas klibbiga ändrestriktionsställen som flankerar din mänskliga gen av intresse.