Tris, eller tris (hydroximetyl) aminometan, är en vanlig biologisk buffert som används under hela DNA-extraktionsprocessen. Under extraktion från valfritt antal källor är DNA pH-känsligt. Under celllys, avlägsnande av oönskade cellulära komponenter och utfällning används tris för att upprätthålla ett stabilt pH. Dessutom spelar det en särskilt viktig roll i celllys.
TL; DR (för lång; Läste inte)
DNA-extraktion är en pH-känslig process, och användning av en tris-buffert hjälper till att hålla pH stabilt över celllys och extraktion.
Tris som en buffert
Eftersom pH kan påverka och påverkas av ett antal cellulära faktorer är det viktigt för experimentell vetenskap att upprätthålla ett stabilt pH. Biologiska buffertar, som tris, är viktiga eftersom de kan upprätthålla ett stabilt pH trots påverkan som annars skulle kunna förändra pH. Tris (hydroximetyl) aminometan, med en pKa på 8,1, är en effektiv buffert mellan pH 7 och 9. På grund av sitt neutrala intervall är tris en vanlig buffert i biologiska laboratorier. Tris-buffert är emellertid temperaturkänslig och bör användas vid den temperatur vid vilken den ursprungligen pH-värdes för att undvika felaktigheter.
Lys av celler
Lys eller att bryta upp cellerna är det första steget med DNA-extraktion. Detta åstadkoms med en buffert innehållande tris och EDTA (etylendiamintetraättiksyra). EDTA binder tvåvärda katjoner som kalcium och magnesium. Eftersom dessa joner hjälper till att upprätthålla cellmembranets integritet destabiliserar membranet genom att eliminera dem med EDTA. Tris är den huvudsakliga buffertkomponenten; Dess huvudroll är att hålla buffertens pH vid en stabil punkt, vanligtvis 8,0. Dessutom tris interagerar sannolikt med LPS (lipopolysackarid) i membranet och tjänar till att destabilisera membranet ytterligare.
Tris skyddar DNA från pH-skift
När cellerna sönderdelas sprutas deras DNA och innehåll i bufferten. Dessutom ingår ofta RNas A (förstör RNA), proteaser (förstör proteiner) och SDS (natriumdodecylsulfat, solubiliserar membranfragmenten). Sammantaget kan denna soppa med cellulärt innehåll och fragmenterat RNA och proteiner ha en stor inverkan på lösningens pH. Eftersom DNA är pH-känsligt är det viktigt för tris att buffra soppan och bibehålla pH på en stadig punkt.
DNA-nederbörd
I det sista steget av DNA-extraktion extraheras DNA: t från lösningen. Vid denna tidpunkt är DNA lösligt i bufferten. För att extrahera från lösningen görs DNA olösligt genom tillsats av etanol eller isopropanol (isopropylalkohol). När detta är gjort blir DNA uppenbart i lösning som en vit, redan klar substans. Även om DNA kan isoleras från de återstående cellulära komponenterna på detta sätt är det inte "användbart" när det är olösligt. Efter isolering avlägsnas alkoholen och DNA måste återföras till en biologisk buffert, som tris, för att användas.
Gör det själv
Även om extraktion av DNA vanligtvis görs i forskningslaboratorier använder man vanligtvis ett av ett antal kommersiellt tillgängliga kit kan vem som helst göra DNA-extraktion hemma med vanliga hushållsartiklar och grönt ärtor eller spenat. I detta fall finns inte tris eller någon biologisk buffert för att skydda DNA från pH-skift. Det är dock ett visuellt sätt att hjälpa eleverna att få kontakt med cellulärt DNA.