Hur ett urval av DNA samlas in och förbereds för studier

Innan de kan sekvensera DNA eller ändra det genom genteknik, måste forskare först isolera det. Detta kan verka som en svår uppgift, eftersom celler innehåller en mängd andra föreningar som proteiner, fetter, sockerarter och små molekyler. Lyckligtvis kan biologer använda DNA: s kemiska egenskaper för att separera DNA från dessa föroreningar och förbereda det för vidare studier. Denna process kallas DNA-extraktion.

Det finns många olika tekniker som används för DNA-extraktion. Den som används av ett enskilt laboratorium beror på vilken typ av experiment som ska utföras och hur rent DNA måste vara. Forskare börjar vanligtvis med ett prov som innehåller celler - till exempel ett vävnads- eller blodprov - och bryter upp cellerna eller lyserar dem. Det finns olika sätt att lysera celler på. Om du tillsätter ett tvättmedel kommer de att bryta isär, liksom att utsätta dem för högfrekventa ljudvågor. Alternativt, om du blandar provet med glaspärlor och vibrerar det snabbt kommer cellerna fysiskt att brytas sönder och frigöra innehållet.

Om hög renhet inte krävs kan forskare lägga till ett enzym som kallas proteinas K för att bryta ner de flesta proteinerna i provet och sedan använda det som det är. Denna teknik är dock mycket smutsig, eftersom de flesta föroreningar fortfarande är närvarande, så det är bara lämpligt om hastighet är en prioritet och renhet är inget problem. Ett annat snabbt och smutsigt tillvägagångssätt är att ta bort proteiner genom att öka saltkoncentrationen genom att tillsätta salter som ammonium eller kaliumacetat för att tvinga proteinerna att fälla ut. Även denna teknik är ganska smutsig eftersom många andra föroreningar fortfarande finns.

Ett annat tillvägagångssätt är att lysera cellerna med tvättmedel och sedan blanda lösningen med isoamylalkohol, kloroform och fenol. Lösningen separeras sedan i två lager. Proteiner hamnar i det övre organiska skiktet, medan DNA förblir i det nedre vattenskiktet. Denna teknik kräver noggrann kontroll av saltkoncentration och pH för goda resultat. Det är tidskrävande och både fenol och kloroform är mycket giftiga kemikalier. Följaktligen, medan extraktioner av fenol-kloroform en gång var rutinmässiga, har andra tekniker blivit mer populära de senaste åren.

Anjonbyteskromatografi ger högre renhet och mer konsekventa resultat än fenol-kloroformextraktion. Ett rör eller en kolonn är packad med små partiklar som har positivt laddade platser på sig där en negativt laddad molekyl eller anjon kan binda. DNA binder till dessa anjonbytesplatser medan andra föroreningar som proteiner och RNA tvättas bort från kolonnen. Senare används en saltrik lösning för att dra DNA från kolonnen.

Den snabbaste och kanske mest pålitliga tekniken för rening av DNA är användningen av ett specialtillverkat kit. Dessa kit innehåller kiselgelmembran i ett rör. DNA fastnar vid membranet medan andra föroreningar tvättas bort med en serie specialberedda saltlösningar som medföljer satsen. Slutligen tvättas DNA av kolonnen med en saltlösning. Dessa kit är snabba, enkla att använda och ger reproducerbara resultat.

När DNA: n har isolerats och återsuspenderats i en pH-kontrollerad buffertlösning är det sista steget att testa dess renhet. Ett enkelt och bekvämt sätt att göra det är att kontrollera hur mycket ultraviolett ljus det absorberar vid våglängderna 260 och 280 nanometer. Absorptionen vid 260 nm dividerad med absorptionen vid 280 nm skulle vara lika med 1,8 om DNA är rent. Genom att mäta absorbansen vid 260 nanometer kan du också bestämma DNA-koncentrationen.