En cells genetiska ritning är kodad i dess genetiska material, eller DNA. Eftersom DNA aldrig lämnar cellens kärna, för att denna information ska komma in i cytoplasman där andra proteiner och biokemiska komponenter finns, är det nödvändigt att först transkribera DNA i messenger-RNA (mRNA eller poly (A) RNA). Detta mRNA översätts sedan till proteiner som utför många funktioner i cellen. För att detektera eller kvantifiera mycket sällsynta mRNA, göra sonder för mikroarrays eller konstruera bibliotek med komplementära DNA-molekyler måste mRNA isoleras. Utvinning av total RNA (dvs. allt RNA i en cell) och efterföljande mRNA-isolering är emellertid inte ömsesidigt exklusiva processer; den förstnämnda måste utföras för att mRNA ska extraheras.
TRIzol-homogenisering: Totalt RNA inkluderar allt mRNA, överförings-RNA, ribosomalt RNA och annat icke-kodande RNA. För att separera dessa från andra cellulära komponenter sprängs cellen först för att frigöra sin innehåll. Detta görs genom att celler återsuspenderas pelleterade genom centrifugering (snurrar vid höga hastigheter) i TRIzol Reagent (Life Technologies). Andra versioner av TRIzol (som Ambions TRI-reagens) fungerar på samma sätt.
Total RNA-isolering: En serie centrifugeringar används för att separera de olika komponenterna (proteiner, DNA, RNA) i cellen i skikt eller faser i suspensionen. Den översta, gulfärgade fasen består av fett och kan kasseras. Den önskade fasen är tonad röd, innehåller totalt RNA och bibehålls. Efter att ha utfört en fenol-kloroformextraktion och en serie alkoholtvättar med isopropanol och etanol kan RNA pelleteras för mRNA-isolering. Lägg till RNase-hämmare för att förhindra att detta enzym försämrar total RNA.
mRNA-extraktion: Det är vanligt att använda ett kit för att isolera mRNA, eftersom hemlagade laboratorieprotokoll inte genererar stora mängder av högt renade mRNA. Kommersiella kit inkluderar Invitrogen's FastTrack 2.0 eller Ambions Poly (A) Pure mRNA Isolation Utrustning. Dessa grundläggande steg är vanliga för sådana kit:
d) Centrifugera detta prov och återvinna supernatanten, som tvättas flera gånger i en serie bindnings- och lågsaltbuffertar som tillhandahålls i satserna.
Referenser
- "cDNA-biblioteksprotokoll?"; Ian G. Cowell och Caroline A. Austin; 1997
- "In vitro-transkriptions- och översättningsprotokoll?"; Martin J. Tymmer; 1995
Tips
- Håll alla reagenser, celler och RNA kalla genom att sänka ner dem i is. Detta förhindrar att RNA bryts ned av andra enzymer som frigörs under homogeniseringsprocessen.
Varningar
- Reagens som TRIzol är giftiga och får inte komma i kontakt med hud eller slemhinnor. Följ alltid säkra laboratorieprotokoll när du hanterar detta reagens.
Om författaren
Palmer Owyoung har en magisterexamen i internationell verksamhet från University of California i San Diego och en Kandidatexamen i sociologi från University of California i Santa Barbara och är utbildad molekylär biolog. Han har varit frilansskribent sedan 2006. Förutom att skriva är han heltidshandlare och internetmarknadsförare.
Fotokrediter
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images