Hur visualiseras DNA med gelelektrofores?

Gelelektrofores är en teknik som gör det möjligt att analysera DNA på nivån av dess ingående molekyler. I denna DNA-visualiseringsmetod placeras prover på ett agarosgelmedium och ett elektriskt fält appliceras på gelén. Detta får fragment av DNA att migrera genom gelén i olika hastigheter i enlighet med deras elektrokemiska egenskaper.

Etidiumbromid

För denna visualiseringsteknik blandas etidiumbromid med agarospulver, EDTA-buffert och vatten för att bilda gelmatrisen före elektrofores. Som ett resultat dispergeras etidiumbromidmolekylerna enhetligt genom matrisen. När gelns brunnar väl har fyllts med sina respektive DNA-prover och spårningsfärger appliceras spänning för att långsamt dra de stora, polära föreningarna över matrisen.

Under denna rörelse binder baserna av DNA-molekylerna tillfälligt till partiklarna tack vare etidiumbromidladdningen och drar dem med. När gelelektrofores är klar har varje DNA-molekyl tagit upp vid en betydande mängd etidiumbromid.

I närvaro av ultraviolett ljus uppvisar etidiumbromid fluorescens. Tekniker lyser ett speciellt kalibrerat UV-ljus över gelén medan en maskin tar bilden av de glödande fragmenten.

instagram story viewer

Metylenblå

Om en UV-transilluminator inte är tillgänglig eller praktisk kan tekniker göra DNA synligt under normalt tillstånd genom blötläggning av den färdiga agarosgelen, med elektroforeserat DNA inuti, i en lösning av metylenblått över natten.

Ett kloridsalt med en signifikant hydrofob anjon, metylenblå molekyler tränger igenom hela gelmatrisen. Vätebindningen genom hela DNA får dock fläckmolekylerna att ackumuleras. Denna ökade DNA-fläckdensitet ger en djupare nyans av blått, synligt för blotta ögat.

Spårfärger

Utöver DNA-bandens relativa storlek kan tekniker mäta den absoluta storleken (i baspar) för varje fragment med hjälp av kemikalier som kallas spårningsfärger. Synlig utan tillsats av metylenblått eller etidiumbromid, spårfärger som bromfenolblått och xylencyanol rör sig över aragosgelmatriser under elektrofores i samma hastighet som DNA-fragment bestående av 300 nukleotider och 4000 nukleotider, respektive. Vid elektrofores färdas mer massiva DNA-fragment över gelmatrisen med en lägre hastighet än mindre fragment. Därför, medan spårningsfärger inte påverkar synligheten av DNA-fragment direkt, jämför positionen för ett DNA-fragment i gelén till positionen för dessa färgämnen tillåter tekniker att "se" det ungefärliga antalet nukleotider DNA-fragmentet innehåller.

Teachs.ru
  • Dela med sig
instagram viewer