Biokemister och molekylärbiologer använder elektrofores för att separera makromolekyler som proteiner och nukleinsyror. Detta gör det möjligt för forskare att isolera och analysera enskilda proteiner eller nukleinsyrasekvenser i en komplex blandning. Ett typiskt exempel på elektrofores i laboratoriet är en mikrobiolog som använder Polymerase Chain Reaction (PCR) för att separera DNA-fragment som produceras i en mikrobiell gemenskap. Oavsett syftet kräver elektrofores alltid användning av en buffertlösning.
TL; DR (för lång; Läste inte)
Elektrofores separerar makromolekyler som protein och nukleinsyror efter storlek, laddning och andra egenskaper. För elektrofores som separeras med laddning använder forskare buffert för att överföra laddningen genom gelén. Buffert håller också gelén vid ett stabilt pH, vilket minimerar förändringar som kan uppstå i proteinet eller nukleinsyran om de utsätts för instabilt pH.
Principer för elektrofores
Elektrofores separerar molekyler längs en gradient baserat på deras storlek, laddning eller andra egenskaper. Denna gradient kan vara ett elektriskt fält eller, i fallet med denaturerande gradientgelelektrofores (DGGE), ett denatureringsmedel såsom en blandning av urea och formamid. Proteiner migrerar mot anoden om de är negativt laddade och katoden om de är positivt laddade. Eftersom större molekyler migrerar långsammare än mindre molekyler kan forskare mäta avståndet och använda logaritmer för att bestämma storleken på fragmenten.
Denaturerande gradientgelelektrofores
Med DGGE rör sig DNA längs en gradient av ökande denatureringsförmåga tills kraften är tillräcklig för att helt denaturera eller utveckla det specifika DNA-fragmentet. Vid den här tiden slutar migreringen. Forskare kan använda denna metod för att separera fragment baserat på deras individuella känslighet för denaturering.
Vad bufferten gör
I fallet med elektrofores som separerar på grundval av laddning överför joner i bufferten den laddning som krävs för separation. Bufferten, genom att tillhandahålla en reservoar med svag syra och bas, håller också pH inom ett smalt område. Detta är viktigt eftersom strukturen och laddningen av ett protein eller nukleinsyra kommer att förändras om de utsätts för betydande pH-förändringar, vilket förhindrar korrekt separation.
Typiska buffertar
Olika buffertar är idealiska för att hålla elektroforesgeln vid olika önskade pH-intervall. Typiska buffertar som används av forskare för detta ändamål inkluderar ättiksyra, borsyra, fosforsyra och citronsyra samt glycin och taurin. I allmänhet bör pKa-värdet (syradissociationskonstant) vara nära det erforderliga pH-värdet. Det är att föredra framför oss buffertar som ger en låg laddningsstorlek för att inte leda för mycket ström.