Који је први корак у ланчаној реакцији полимеразе?

Ланчана реакција полимеразе или ПЦР је техника која фотокопира један фрагмент ДНК у много фрагмената - експоненцијално много. Први корак је у ПЦР-у да се ДНК загреје тако да она денатурише или се истопи у појединачне нити. Структура ДНК је попут мердевина ужета у којима су пречке ужад са магнетним крајевима. Магнети се повезују и формирају пречке, назване основни парови, и на тај начин се опиру раздвајању. Сваки фрагмент ДНК топи се у појединачне нити на различитим температурама. Разумевање како структуру ДНК држе заједно поједини делови ДНК даће увид у то зашто различити фрагменти ДНК се топе на различитим температурама и зашто су у почетку потребне тако високе температуре место.

Први корак ПЦР-а је растопити ДНК тако да се дволанчана ДНК раздвоји у једноланчану ДНК. За ДНК сисара, овај први корак обично укључује топлоту од приближно 95 степени Целзијуса (око 200 Фахренхеита). На овој температури, водоничне везе између А-Т и Г-Ц базних парова, или пречке у лествици ДНК, распадају се, растварајући дволанчану ДНК. Међутим, температура није довољно врућа да сломи фосфатно-шећерну окосницу која формира појединачне нити или полове мердевина. Потпуно раздвајање појединачних ланаца припрема их за други корак ПЦР-а, који се хлади како би се омогућило да кратки фрагменти ДНК, названи прајмери, вежу појединачне ланце.

Један од разлога због којег се ДНК загрева на високој температури од 95 степени Целзијуса је тај што што је дужа нит двоструке ДНК дужа, то више жели да остане заједно. Дужина ДНК је један од фактора који утиче на тачку топљења одабрану за ПЦР на том комаду ДНК. Парови база А-Т и Г-Ц у дволанчаној ДНК вези једни са другима држе дволанчану структуру заједно. Што се више узастопних базних парова између две једноструке нити веже, то њихови суседи такође желе да се везују, и привлачност између две нити постаје све јача. То је попут затварача од малих магнета. Кад затворите патентни затварач, магнети ће природно желети да се закопчају и остану патентни затварачи.

Још један фактор који утиче на одабир температуре топљења за ваш ДНК фрагмент који вас занима је количина Г-Ц базних парова присутних у том фрагменту. Сваки основни пар је попут два мини-магнета који привлаче. Пар израђен од Г и Ц много је снажније привучен од пара А и Т. Тако ће комаду ДНК који има више Г-Ц парова од другог фрагмента бити потребна виша температура пре топљења у појединачне нити. ДНК природно апсорбује ултраљубичасту светлост - тачније на таласној дужини од 260 нанометара - и једноланчана ДНК апсорбује више светлости него дволанчана ДНК. Дакле, мерење количине апсорбоване светлости је начин мерења колико се ваша дволанчана ДНК стопила у појединачне нити. Ефекат "магнетног затварача" Г-Ц и А-Т базних парова је оно што узрокује графикон апсорбанције светлости дволанчана ДНК зацртана против повећања температуре да буде сигмоидна, облика С, а не а Права линија. Крива С представља отпор тимског рада који базни парови врше против топлоте јер не желе да се раздвоје.

Температура на којој се дужина ДНК топи у појединачне нити назива се њена температура топљења, која се означава скраћеницом „Тм“. То указује на температуру на којој се половина ДНК у раствору истопила у једноланчане, а друга половина је још увек у дволанчаним облик. Температура топљења је различита за сваки фрагмент ДНК. ДНК сисара има садржај Г-Ц од 40%, што значи да је преосталих 60% парова база Ас и Тс. Његов садржај од 40% Г-Ц доводи до топљења ДНК сисара на 87 степени Целзијуса (око 189 Фахренхеита). Због тога је први корак ПЦР-а на ДНК сисара загревање на 94 степени Целзијуса (201 Фахренхеит). Само седам степени топлије од температуре топљења и све двоструке нити ће се потпуно стопити у једноструке нити.