Шта је замрзавање ломљења и зашто је корисно у ћелијској биологији?

Ћелијске мембране састоје се од фосфолипида и везаних или уграђених протеина. Мембрански протеини играју виталну улогу у метаболизму и животу ћелије. Не можете користити уобичајену микроскопију за визуелизацију или карактеризацију адхезивних протеина, транспортних протеина и протеинских канала у ћелијској мембрани. Коришћењем електронске микроскопије и технике која се назива „замрзавање прелома“, која раздваја замрзнуте ћелијске мембране, омогућава визуелизацију мембранске структуре и организацију протеина у мору фосфолипиди. Комбиновање других метода са смрзавајућим ломљењем не само да нам помаже да разумемо структуру различитих ћелијских мембрана и мембранских протеина, али омогућава визуелизацију и детаљну анализу функције специфичних протеина, бактерија и вируси.

Користећи течни азот, биолошки узорци ткива или ћелије се брзо замрзавају да би имобилизовали ћелијске састојке. Ћелијске мембране састоје се од два слоја фосфолипида, која се називају двослој, где хидрофобни или мрзећи воду липидни репови показују на унутрашњост мембране и хидрофилни крајеви молекула липида који воле воду, усмјерени су према ван и према унутрашњости ћелија. Смрзнути узорак је напукнут или сломљен микротомом, који је инструмент попут ножа за сечење танких кришки ткива. Ово доводи до раздвајања ћелијске мембране између два слоја, јер привлачност између хидрофобних липидних репова представља најслабију тачку. Након ломљења, узорак се подвргава вакуумском поступку, који се назива „замрзавање нагризањем“. Површина прелома узорак је засенчен паром угљеника и платине да би се добила стабилна реплика која прати контуре прелома авион. Киселина се користи за варење органског материјала који се лепи за реплику, остављајући танку платинасту шкољку на преломљеној површини мембране. Затим се ова љуска анализира електронском микроскопијом.

Замрзавање нагризање је вакуумско сушење непомичног, смрзнутог и смрзнутог лома биолошког узорка. Поступак вакуумског сушења сличан је замрзавању сушења воћа и поврћа које се пакује и продаје у продавницама прехрамбених производа. Без замрзавања, многи детаљи ћелијске структуре замрачени су кристалима леда. Корак дубоког или замрзавања побољшава и проширује оригиналну методу прелома смрзавањем, омогућавајући посматрање ћелијских мембрана током различитих активности. Омогућава анализу не само мембранске структуре, већ и унутарћелијских компонената и пружа детаљне структурне информације о бактеријама, вирусима и великим ћелијским протеинима комплекси.

Електронска микроскопија може открити и увећати више од милион пута најситнијих организама или структура, као што су бактерије, вируси, унутарћелијске компоненте, па чак и протеини. Визуализација се ствара бомбардирањем ултра танког узорка снопом електрона. Две методе електронске микроскопије су скенирајућа електронска микроскопија (СЕМ) и трансмисиона електронска микроскопија (ТЕМ). Узорци прелома замрзавања рутински се анализирају помоћу ТЕМ. ТЕМ има бољу резолуцију од СЕМ-а и нуди структурне информације до 3 нанометра реплика.

Развој и употреба електронске микроскопије смрзнутог прелома показали су да су ћелијске мембране плазме изграђене од двослојних липида и разјаснило је како су протеини организовани унутар ћелијских мембрана. Ломљени прелом даје јединствени поглед на унутрашњост ћелијских мембрана, јер се цепа и раздваја мембранске фосфолипиде на два супротна и комплементарна слоја или лица. Током више од 50 година од увођења прве машине за замрзавање прелома, прављење реплике платине и даље је једини начин да се добију структурне информације о ћелијској мембрани. Техника показује да ли одређени протеини плутају или су усидрени у ћелијској мембрани и да ли се и како неки протеини агрегирају. Новија метода - коришћење антитела која циљају специфичне протеине - комбинује се са смрзавајућим преломом да би се идентификовали протеини и њихова функција у ћелијској мембрани.