Клонирање ДНК: дефиниција, поступак, примери

Могуће је клонирати читаве организме попут овце Доли, али клонирање ДНК је другачије. За израду користи технике молекуларне биологије идентичне копије ДНК секвенци или појединачних гена.

Помоћу метода генетског инжењеринга идентификују се и изолују сегменти ДНК генетског кода. Клонирање ДНК затим копира нуклеинске киселине секвенце у сегментима.

Добијене идентичне копије могу се користити за даља истраживања или за биотехнолошке примене. Копирани ген често кодира протеин који може бити део медицинских третмана. ДНК технологија укључујући Клонирање ДНК подржава разумевање како гени раде и како генетски код људи утиче на функционисање тела.

Клонирање ДНК је поступак молекуларне биологије прављења идентичних копија сегмената ДНК смештених у хромозомима који садрже генетски код напредних организама.

Процес генерише велике количине циљне секвенце ДНК. Циљ ДНК клонирања је да произведе саме циљне секвенце ДНК или да произведе протеине кодиране у циљним секвенцама.

Позване су две методе које се користе у клонирању ДНК вектор плазмида и ланчана реакција полимеразе (ПЦР). У вектор плазмида методом, ДНК нити се пресецају помоћу рестрикциони ензими да би се добили фрагменти ДНК, а резултујући сегменти се убацују у векторе клонирања који се називају плазмиди за даље дуплирање. Плазмиди се смештају у бактеријске ћелије које затим производе ДНК копије или кодиране протеине.

У ПЦР метода, сегмент ДНК ланаца који се дуплира означен је ензимима тзв прајмери. Ензим полимеразе прави копије обележеног дела ланца ДНК. Ова метода не користи рестрикционе ензиме и може да произведе клонирану ДНК из малих узорака. Понекад се две методе ДНК технологије користе заједно како би се уградиле најбоље особине сваке од њих у укупну реакцију.

Вектор методе односи се на плазмид који се користи за задржавање циљног сегмента ДНК који се клонира. Плазмиди су мали кружни праменови нехромозомска ДНК налази се у многим организмима, укључујући бактерије и вирусе.

Бактеријски плазмиди су вектор који се користи за уметање циљног сегмента ДНК у бактеријске ћелије ради даљег умножавања.

Одабир и изолација циљне ДНК: Пре него што започне процес клонирања ДНК, морају се идентификовати секвенце ДНК, посебно почеци и крајеви ДНК сегмената.

Такве секвенце ДНК могу се наћи коришћењем постојеће клониране ДНК са познатим секвенцама или проучавањем протеина произведеног циљном секвенцом ДНК. Једном када је секвенца позната, могу се користити одговарајући рестрикциони ензими.

Резање циљне ДНК рестрикционим ензимима: Рестриктивни ензими су изабрани да траже ДНК код на почетку и на крају циљних секвенци.

Када рестрикциони ензими пронађу посебну кодирану секвенцу базних парова која се називају рестрикциона места, они вежу се за ДНК на том месту и навијају се око молекула ДНК, раскидајући нит. Исечени ДНК сегменти који садрже циљну секвенцу сада су доступни за дуплирање.

Избор плазмидног вектора и уметање циљне ДНК: Погодан плазмид идеално садржи исте секвенце кодирања ДНК као и ДНК ланац од којег је одрезана циљана ДНК. Кружни ДНК ланац плазмида се пресеца истим рестрикционим ензимима који су коришћени за сечење циљне ДНК.

А. Ензим ДНК лигазе се користи за промоцију повезивања ДНК сегмената, а крајеви циљног сегмента ДНК повезују се са пресеченим крајевима плазмидне ДНК. Циљна ДНК сада чини део кружног ланца плазмидне ДНК.

Уметање плазмида у бактеријску ћелију: Једном када плазмид садржи секвенцу ДНК коју треба клонирати, стварно клонирање може се извршити помоћу процеса тзв бактеријска трансформација. Плазмиди се убацују у бактеријску ћелију као што је Е. цоли, а ћелије са новим ДНК сегментима почеће да производе копије и одговарајуће протеине.

У бактеријској трансформацији, ћелије домаћини и плазмиди се инкубирају заједно на телесној температури око 12 сати. Ћелије апсорбују неке од плазмида и третирају их као своју плазмидну ДНК.

Берба клониране ДНК и протеина: Већина плазмида који се користе за клонирање ДНК имају гени отпорности на антибиотике уграђени у њихову ДНК. Како бактеријске ћелије апсорбују нове плазмиде, оне постају отпорне на антибиотике.

Када се култура третира антибиотицима, опстају само оне ћелије које су апсорбовале нове плазмиде. Резултат је чиста култура бактеријских ћелија са клонираном ДНК. Тада се ДНК може сакупљати или произвести одговарајући протеин.

Тхе ПЦР метода је једноставнија и копира постојећу ДНК на месту. Не захтева резање рестрикционим ензимима или уметање плазмидДНК секвенце. То га чини посебно погодним за клонирање узорака ДНК са ограниченим бројем ДНК ланаца. Иако метода може да клонира ДНК, не може се користити за производњу одговарајућег протеина.

Откривање ДНК ланаца: ДНК у хромозомима је чврсто увијена у структуру двоструке завојнице. Загревање ДНК на 96 степени Целзијуса у процесу тзв денатурација чини да се молекул ДНК одмота и раздвоји на два ланца. Ово раздвајање је потребно јер се одједном може клонирати само један ланац ДНК.

Одабир прајмера: Као и код клонирања ДНК плазмидних вектора, секвенце ДНК које се клонирају морају се идентификовати са посебним нагласком на почетке и крајеве ДНК сегмената. Примери су ензими који се вежу за одређене секвенце ДНК кода и они морају бити изабрани да обележе циљне сегменте ДНК. Прави прајмери ​​ће се прикачити за секвенце молекула ДНК да означе почетке и крајеве циљних сегмената.

Жар реакције везивања прајмера: Позвано је хлађење реакције на око 55 степени Целзијуса жарење. Како се реакција хлади, прајмери ​​се активирају и вежу за ДНК ланац на сваком крају циљног ДНК сегмента. Прајмери ​​делују само као маркери и ДНК ланац не мора да се пресече.

Израда идентичних копија циљног ДНК сегмента: У процесу тзв продужење, реакцији се додаје ензим ТАК полимеразе осетљив на топлоту. Реакција се затим загрева на 72 степена Целзијуса, активирајући ензим. Активни ензим ДНК полимераза везује се за прајмере и копира секвенцу ДНК између њих. Почетни поступак секвенцирања и клонирања ДНК је завршен.

Повећање приноса клониране ДНК: Почетни процес жарења и продужења ствара релативно мало копија доступних сегмената ланца ДНК. Да би се повећао принос додатном репликацијом ДНК, реакција се поново охлади да би се прајмери ​​поново активирали и оставили да се вежу за друге ДНК ланце.

Затим се поновним загревањем реакције поново активира ензим полимераза и производи се више копија. Овај циклус се може поновити 25 до 30 пута.

Метода плазмидног вектора ослања се на довољно почетних залиха ДНК за пресецање и убацивање у плазмиде. Премало оригиналне ДНК резултира са мање плазмида и полаганим почетком клониране производње ДНК.

ПЦР метода може произвести велику количину ДНК из неколико оригиналних ДНК ланаца, али пошто ДНК није имплантирана у бактеријску ћелију, производња протеина није могућа.

За производњу протеина кодираног у фрагментима ДНК који се клонирају из малог почетног узорка ДНК, две методе се могу користити заједно, а могу и Похвалити један другог. Прво се метода ПЦР користи за клонирање ДНК из малог узорка и стварање многих копија.

Затим се ПЦР производи користе плазмидном векторском методом за имплантацију произведене ДНК у бактеријске ћелије које ће произвести жељени протеин.

Молекуларна биологија користи клонирање гена и репликацију ДНК у медицинске и комерцијалне сврхе. Бактерије са клонираним ДНК секвенцама користе се за производњу лекова и замену супстанци које људи са генетским поремећајима не могу сами да произведу.

Типичне употребе укључују:

• Ген за хумани инсулин је клониран у бактерије које потом производе инсулин који користе дијабетичари.
• Активатор плазминогена у ткиву се производи од клониране ДНК и користи се за помоћ спречити стварање крвних угрушака.
• Људски хормон раста може се произвести и применити људима који то не могу сами произвести.

Биотехнологија такође користи клонирање гена у пољопривреди за стварање нових карактеристика код биљака и животиња или за побољшање постојећих карактеристика. Како се клонира више гена, број могућих употреба експоненцијално се повећава.

Молекули ДНК чине мали део материјала у живој ћелији и тешко је изоловати утицаје многих гена. Методе клонирања ДНК достављају велике количине специфичне секвенце ДНК за проучавање, а ДНК производи протеине баш као и у оригиналној ћелији. Клонирање ДНК омогућава проучавање ове операције за различите гене у изолацији.

Типичне апликације за истраживање и ДНК технологију укључују испитивање:

• Функција гена.
• Мутације гена.
• Експресија гена.
• Генски производи.
• Генетске мане.

Када се клонира више ДНК секвенци, лакше је пронаћи и клонирати додатне секвенце. Постојећи клонирани сегменти ДНК могу се користити да би се утврдило да ли се нови сегмент подудара са старим и који су делови различити. Тада је идентификовање циљне секвенце ДНК брже и тачније.

У генска терапија, клонирани ген је представљен ћелијама организма чији је природни ген оштећен. Витални ген који производи протеин потребан за одређену функцију организма може бити мутиран, промењен зрачењем или под утицајем вируса.

Када ген не ради правилно, у ћелији недостаје важна супстанца. Генска терапија покушава заменити ген клонираном верзијом која ће произвести потребну супстанцу.

Генска терапија је и даље експериментална, а мало је пацијената излечено техником. Проблеми леже у идентификовању једног гена који је одговоран за здравствено стање и испоруци многих копија гена у праве ћелије. Како је клонирање ДНК постајало све раширеније, генска терапија се примењивала у неколико специфичних ситуација.

Недавне успешне апликације су:

• Паркинсонова болест: Користећи вирус као вектор, ген повезан са Паркинсоновом болешћу убризган је у средњи мозак пацијената. Пацијенти су искусили побољшане моторичке способности без икаквих нежељених нежељених ефеката.
• Недостатак аденозин деаминазе (АДА): Генетски имуни поремећај лечен је уклањањем матичних ћелија крви пацијената и уметањем гена АДА. Као резултат, пацијенти су могли да произведу бар неки свој АДА.
• Хемофилија: Људи са хемофилијом не производе специфичне протеине који помажу у згрушавању крви. Ген за производњу једног од недостајућих протеина убачен је у ћелије јетре пацијената. Пацијенти су произвели протеине и инциденти са крварењем су смањени.

Генска терапија је једна од најперспективнијих примена клонирања ДНК, али друге нове употребе ће се вероватно размножавати како се проучава више ДНК секвенци и одређује њихова функција. Клонирање ДНК даје сировине за генетски инжењеринг у потребним количинама.

Када је улога гена позната и њихова исправна функција може се осигурати заменом неисправних гени, многе хроничне болести, па чак и рак могу бити нападнути и лечени на генетском нивоу коришћењем ДНК технологија.

Сличан садржај:

• Карактеристике колоније Е.Цоли (Есцхерицхиа Цоли)
• РНК: Дефиниција, функција, структура