У молекуларној биологији може бити добар избор пуфера и припрема за различите кораке изолације ДНК разлика између преласка на експресију протеина или отварања другог макси-препарата за почетак готово. Упркос својој пресудној важности, пуферски рецепти су често управо то - рецепти написани без објашњења или образложења за различите компоненте. Један од таквих пуфера је глукоза-трис-ЕДТА или ГТЕ пуфер.
За шта се користи ГТЕ?
ГТЕ се користи за ресуспендирање пелета бактеријских ћелија пре лизирања (отварања) ћелија и сакупљања плазмидне ДНК изнутра. Лизозим, који омекшава ћелијске мембране, често се додаје заједно са ГТЕ пуфером. Постизање хомогене суспензије целих ћелија током овог корака, тако да накнадно додати раствор за лизу може доћи до свих ћелија, кључно је за добијање добрих приноса ДНК. ГТЕ је дизајниран да то учини, истовремено пружајући стабилно окружење за ДНК.
Глукоза за осмоларност
50мМ (милимоларни) глукозни шећер се додаје у ГТЕ пуфер да би се одржао осмоларитет тамо где је концентрација раствореног средства изван ћелија близу оне унутар ћелија. Ово спречава превремену лизу ћелија, што може довести до нижих приноса ДНК због агрегације и разградње. Остале компоненте пуфера такође доприносе осмоларности раствора, али глукоза, јер је не-електролит, добар је избор јер не омета пуфер раствора својства.
Трис за пХ стабилност
Трис је кратко име за трис (хидроксиметил) аминометан, што је врло чест пХ пуфер. У случају ГТЕ пуфера, кисела со (Трис-ХЦл) се додаје у пуфер у концентрацији од 25 мМ. Овим се одржава пХ раствора на скоро физиолошких 8,0, идеалан пХ за спречавање киселе хидролизе (разградње) плазмидне ДНК и нежељених споредних реакција осталих ћелијских компоненти.
ЕДТА спречава деградацију ДНК
ЕДТА, или етилендиаминтетрасирћетна киселина, хвата или „хелира“ металне јоне из раствора, спречавајући их да учествују у нежељеним нежељеним реакцијама. У ГТЕ пуфер ЕДТА се додаје на 10 мМ. Његова примарна намена је у пуферу да заокружи слободни цинк, магнезијум и калцијум, спречавајући тако деградацију ДНК одређеним путевима који захтевају те метале.
Неки важни савети
Нека ваш ГТЕ пуфер буде хладан и направите га у малим количинама како бисте спречили раст нежељених бактерија у њему. Шећер и контролисани пХ чине одличан медијум за раст. Увек користите пречишћену воду. Вода из славине може имати вишак јона метала из цеви, што може надвладати способност ЕДТА да ухвати. Ако сумњате на присуство ометајуће РНК у вашем узорку, додајте РНазу А у количини од 100 микрограма по милилитру у свој ГТЕ бафер да бисте елиминисали проблем.