Када радите са течном хроматографијом високих перформанси (ХПЛЦ), добра калибрација је од пресудног значаја како би се осигурали поуздани, квалитетни резултати. Правилна калибрација ХПЛЦ инструмента започиње са израдом одговарајућег еталона за калибрацију. У већини случајева, калибрација заправо захтева низ стандарда повећања концентрације како би се произвела оно што је познато као калибрациона крива. Ово је уцртана линија и придружена једначина која описује однос између концентрације хемикалије за коју се испитује и одзива ХПЛЦ детектора.
Одредите хемикалију за коју желите да тестирате коришћење ХПЛЦ („аналит“). На пример, можда бисте желели да тестирате серију безалкохолних пића на садржај фруктозе, у ком случају би фруктоза била аналит.
Набавите количину хемикалије аналита одговарајуће чистоће. Чистоћа би обично требало да буде изнад 99%, а аналит би требало да се купи од реномиране компаније за снабдевање хемикалијама. На пример, у случају фруктозе, чисту фруктозу бисте купили од продавца хемикалија, а не од продавнице прехрамбених производа.
Одредите максималну и минималну очекивану концентрацију аналита у узорцима које намеравате да тестирате на ХПЛЦ. У случају безалкохолних пића, прегледали бисте етикете пића и утврдили најнижи и највећи садржај фруктозе међу пићима која ћете тестирати. Имајте на уму да се почетни узорак (безалкохолно пиће) може разблажити или на други начин манипулисати током припреме за анализу (у зависности од ХПЛЦ методе која се користи) и тако може бити концентрација аналита у узорцима који се стварно ињектирају у ХПЛЦ измењен. Мора се узети у обзир концентрација аналита у узорцима која се покреће на ХПЛЦ.
Одредите растварач у којем ћете растворити аналит да бисте направили калибрационе стандарде. Овај растварач мора бити у стању да правилно раствори аналит у релативно широком опсегу концентрације (најмање онолико висок као у узорцима које намеравате да тестирате). Такође, овај растварач би у идеалном случају требало да буде прилично сличан „мобилној фази“, растварачу који се користи за пренос узорака кроз ХПЛЦ инструмент.
Израчунајте количину аналита која је потребна да би се направило „стандардно“ решење аналита. То се постиже множењем потребне концентрације основног стандарда са жељеном запремином. Концентрација аналита у овом раствору треба да буде најмање 10% већа од највише очекиване концентрације узорка. Ако је највиша очекивана концентрација фруктозе у узорку безалкохолних пића 8 грама / 100 милилитара, тада би се основни стандард могао постићи до концентрације 10 грама фруктозе / 100 милилитара. Разумна запремина је 500 милилитара, па би било потребно 8/100 мл к 500 мл = 40 грама фруктозе.
Измерите потребну количину аналита на одговарајући ниво прецизности. Често је погодна вредност тежине у грамима са тачношћу на једну или две децимале, али за неке методе може бити потребна већа прецизност.
Премерени аналит пребаците у мерну тиквицу потребне запремине и додајте жељени растварач до ознаке пуњења на тиквици. Употреба мерне тиквице (на пример уместо градуиране чаше) повећава прецизност вредности стандардне концентрације залихе. Обезбедити да се сав аналит пренесе у тиквицу; ако је потребно, употребите део растварача за прање.
Направите серију различитих разблажења основног стандарда преношењем познатих количина основног стандарда у мерне тиквице, користећи пипете за тачан пренос, а затим додајте растварач. Најнижа стандардна концентрација треба да буде испод најниже очекиване вредности узорка за анализу. У примеру безалкохолних пића, ако је најнижа очекивана концентрација фруктозе у узорку 2 грама / 100 мл, тада се може направити стандард од 1 грама / 100 мл. То би се постигло десетоструким разблаживањем основног стандарда. Стандардне серије треба да садрже укупно 5 или 6 концентрација, па би била потребна додатна разблажења да би се произвели стандарди од можда 3, 5 и 8 грама фруктозе / мл. Сада имате серију стандардних решења помоћу којих можете калибрисати ХПЛЦ.