Kaj je zamrznjeno lomljenje in zakaj je koristno v celični biologiji?

Celične membrane so sestavljene iz fosfolipidov in pritrjenih ali vgrajenih beljakovin. Membranski proteini igrajo ključno vlogo pri presnovi in ​​življenju celice. Navadne mikroskopije ne morete uporabiti za vizualizacijo ali karakterizacijo adhezijskih proteinov, transportnih beljakovin in beljakovinskih kanalov v celični membrani. Z uporabo elektronske mikroskopije in tehnike, imenovane "zmrznjeni zlom", ki zamrzne celične membrane deli narazen, omogoča vizualizacijo membranske strukture in organizacijo beljakovin v morju fosfolipidi. Kombinacija drugih metod z zamrzovalnim lomljenjem nam ne pomaga le razumeti zgradbe različnih celičnih membran in membranskih beljakovin, vendar omogoča vizualizacijo in podrobno analizo delovanja določenih beljakovin, bakterij in virusi.

Z uporabo tekočega dušika biološke vzorce tkiva ali celice hitro zamrznemo, da imobiliziramo sestavine celic. Celične membrane so sestavljene iz dveh slojev fosfolipidov, imenovanih dvoplast, kjer hidrofobni ali sovražni lipidni repi kažejo na notranjost membrane in hidrofilni ali vodoljubni konci molekule lipidov kažejo navzven in proti notranjosti celica. Zamrznjeni vzorec je razpokan ali zlomljen z mikrotomom, ki je nožu podoben instrument za rezanje tankih rezin tkiva. To povzroči, da se celična membrana natančno razdeli med dve plasti, ker privlačnost med hidrofobnimi lipidnimi repi predstavlja najšibkejšo točko. Po lomljenju se vzorec opravi z vakuumskim postopkom, imenovanim "zamrznjeno jedkanje". Površina loma vzorec je zasenčen z ogljikovimi in platininimi hlapi, da se naredi stabilna kopija, ki sledi konturi loma letalo. Kislina se uporablja za prebavo organskega materiala, ki se drži replike, pri čemer ostane tanka platinasta lupina zlomljene površine membrane. Nato se ta lupina analizira z elektronsko mikroskopijo.

Zamrznjeno jedkanje je vakuumsko sušenje nepomičnega, zamrznjenega in zmrznjenega biološkega vzorca. Postopek sušenja pod vakuumom je podoben sušenju z zamrzovanjem sadja in zelenjave, ki se pakira in prodaja v trgovinah. Brez ledenega jedkanja so številni detajli celične strukture zakriti z ledenimi kristali. Korak globokega ali zamrzovalnega jedkanja izboljša in razširi prvotno metodo zamrznjenega loma, kar omogoča opazovanje celičnih membran med različnimi aktivnostmi. Omogoča analizo ne samo strukture membrane, temveč tudi znotrajceličnih komponent in nudi podrobne strukturne informacije o bakterijah, virusih in velikih celičnih beljakovinah kompleksi.

Elektronska mikroskopija lahko razkrije in poveča več kot milijonkrat najmanjše organizme ali strukture, kot so bakterije, virusi, znotrajcelične komponente in celo beljakovine. Vizualizacija je ustvarjena z bombardiranjem ultra tankega vzorca s snopom elektronov. Metodi elektronske mikroskopije sta skenirajoča elektronska mikroskopija ali SEM in transmisijska elektronska mikroskopija ali TEM. Zamrznjeni vzorci zlomov se rutinsko analizirajo s TEM. TEM ima boljšo ločljivost kot SEM in ponuja strukturne informacije do 3 nanometrov replik.

Razvoj in uporaba elektronske mikroskopije z zamrzovalnim zlomom sta pokazala, da so celične plazemske membrane sestavljene iz dvoslojnih lipidov, in pojasnili, kako so beljakovine organizirane znotraj celičnih membran. Zmrznjeni zlom daje edinstven pogled na notranjost celičnih membran, ker cepi in ločuje membranske fosfolipide na dva nasprotna in komplementarna lista ali ploskve. V več kot 50 letih od uvedbe prvega stroja za zmrznjeno lomljenje je izdelava replike platine še vedno edini način za pridobitev strukturnih informacij o celični membrani. Tehnika prikazuje, ali določeni proteini plavajo ali so zasidrani v celični membrani ter ali in kako se nekateri proteini agregirajo. Novejša metoda - z uporabo protiteles, ki ciljajo na določene beljakovine - je kombinirana z zmrznjenim zlomom za prepoznavanje beljakovin in njihove funkcije v celični membrani.