Kloniranje DNA: opredelitev, postopek, primeri

Možno je klonirati cele organizme, kot je ovca Dolly, vendar je kloniranje DNA drugačno. Za izdelavo uporablja tehnike molekularne biologije enake kopije zaporedij DNA ali posameznih genov.

Z uporabo metod genskega inženiringa se identificirajo in izolirajo segmenti genske kode DNA. Kloniranje DNA nato kopira nukleinska kislina zaporedja v odsekih.

Nastale enake kopije lahko uporabimo za nadaljnje raziskave ali za biotehnološke aplikacije. Kopirani gen pogosto kodira beljakovine, ki so lahko del zdravljenja. DNA tehnologija vključno Kloniranje DNA podpira razumevanje, kako geni delujejo in kako genska koda ljudi vpliva na delovanje telesa.

Kloniranje DNA je postopek molekularne biologije izdelave enakih kopij segmentov DNA, ki se nahajajo v kromosomih in vsebujejo genetsko kodo naprednih organizmov.

Postopek ustvarja velike količine ciljna zaporedja DNA. Cilj kloniranja DNA je sam izdelati ciljna zaporedja DNA ali proizvesti beljakovine, kodirane v ciljnih zaporedjih.

Imenujeta se dve metodi, ki se uporabljata pri kloniranju DNA plazmidni vektor in verižna reakcija s polimerazo (PCR). V plazmidni vektor metode, se DNA verige razrežejo z uporabo restrikcijski encimi da nastanejo fragmenti DNA, nastali segmenti pa se vstavijo v klonirajoče vektorje, imenovane plazmidi, za nadaljnje podvajanje. Plazmidi so nameščeni v bakterijskih celicah, ki nato ustvarijo kopije DNA ali kodirane beljakovine.

V PCR metoda, segment verig DNA, ki se podvaja, je označen z encimi, imenovanimi primerji. Encim polimeraze naredi kopije označenega dela verige DNA. Ta metoda ne uporablja restrikcijskih encimov in lahko iz majhnih vzorcev proizvede klonirano DNA. Včasih se dve tehnologiji DNK uporabljata skupaj, da se v celotno reakcijo vključijo najboljše lastnosti vsake od njih.

Vektor metode se nanaša na plazmid, ki se uporablja za zadrževanje ciljnega segmenta DNA za kloniranje. Plazmidi so majhni krožni prameni nekromosomska DNA najdemo v številnih organizmih, vključno z bakterijami in virusi.

Bakterijski plazmidi so vektor, ki se uporablja za vstavljanje ciljnega segmenta DNA v bakterijske celice za nadaljnje podvajanje.

Izbira in izolacija ciljne DNA: Preden se začne postopek kloniranja DNA, je treba identificirati zaporedja DNA, zlasti začetke in konce segmentov DNA.

Takšna zaporedja DNA lahko najdemo z uporabo obstoječe klonirane DNA z znanimi zaporedji ali s preučevanjem beljakovin, ki jih proizvaja ciljno zaporedje DNA. Ko je zaporedje znano, lahko uporabimo ustrezne restrikcijske encime.

Rezanje ciljne DNA z restrikcijskimi encimi: Restrikcijski encimi so izbrani tako, da iščejo kodo DNA na začetku in koncu ciljnih zaporedij.

Ko restrikcijski encimi najdejo posebno kodirano zaporedje baznih parov, imenovanih restrikcijska mesta, jih pritrdijo se na DNK na tem mestu in se navijajo okoli molekule DNK, pri čemer pretrgajo pramen. Izrezani segmenti DNA, ki vsebujejo ciljno zaporedje, so zdaj na voljo za podvajanje.

Izbira plazmidnega vektorja in vstavljanje ciljne DNA: Primeren plazmid idealno vsebuje enaka zaporedja kodiranja DNA kot veriga DNA, iz katere je bila odrezana ciljna DNA. Krožno verigo DNA plazmida razrežemo z enakimi restrikcijskimi encimi, kot smo jih uporabili za rezanje ciljne DNA.

A Encim DNA ligaze se uporablja za spodbujanje povezovanja segmentov DNA, konci ciljnega segmenta DNA pa se povežejo z odrezanimi konci plazmidne DNA. Ciljna DNA je zdaj del krožne plazmidne verige DNA.

Vstavljanje plazmida v bakterijsko celico: Ko plazmid vsebuje zaporedje DNA, ki ga je treba klonirati, lahko dejansko kloniranje poteka s pomočjo imenovanega postopka bakterijska transformacija. Plazmidi se vstavijo v bakterijsko celico, kot je E. coli, celice z novimi segmenti DNA pa bodo začele proizvajati kopije in ustrezne beljakovine.

Pri bakterijski transformaciji gostiteljske celice in plazmidi inkubiramo skupaj pri telesni temperaturi približno 12 ur. Celice absorbirajo nekatere plazmide in jih obravnavajo kot svojo lastno plazmidno DNA.

Nabiranje klonirane DNA in beljakovin: Večina plazmidov, ki se uporabljajo za kloniranje DNA, ima geni za odpornost na antibiotike vključeni v njihovo DNK. Ko bakterijske celice absorbirajo nove plazmide, postanejo odporne na antibiotike.

Ko kulturo zdravimo z antibiotiki, preživijo le tiste celice, ki so absorbirale nove plazmide. Rezultat je čista kultura bakterijskih celic s klonirano DNA. Nato lahko DNA poberemo ali proizvedemo ustrezne beljakovine.

The PCR metoda je preprostejša in kopira obstoječo DNK na mestu. Ne zahteva rezanja z restrikcijskimi encimi ali vstavljanja plazmidDNK zaporedja. Zaradi tega je še posebej primeren za kloniranje vzorcev DNA z omejenim številom verig DNA. Čeprav metoda lahko klonira DNA, je ni mogoče uporabiti za proizvodnjo ustreznih beljakovin.

Odkrivanje verig DNA: DNA v kromosomih je tesno navita v dvojno vijačno strukturo. Segrevanje DNA na 96 stopinj Celzija v postopku, imenovanem denaturacija povzroči, da se molekula DNA odvije in loči v dve verigi. Ta ločitev je potrebna, ker je mogoče naenkrat klonirati samo eno verigo DNA.

Izbira temeljnih premazov: Tako kot pri kloniranju DNA plazmidnih vektorjev je treba tudi zaporedja DNA, ki jih je treba klonirati, identificirati s posebnim poudarkom na začetkih in koncih segmentov DNA. Primeri so encimi, ki se vežejo na specifična zaporedja DNA in jih je treba izbrati, da označijo ciljne segmente DNA. Pravi začetniki se pritrdijo na zaporedja molekul DNA, da označijo začetke in konce ciljnih segmentov.

Žarjenje reakcije za vezavo temeljnih premazov: Imenuje se hlajenje reakcije na približno 55 stopinj Celzija žarjenje. Ko se reakcija ohladi, se začetniki aktivirajo in pritrdijo na verigo DNA na vsakem koncu ciljnega segmenta DNA. Primeri delujejo le kot označevalci in verige DNA ni treba rezati.

Izdelava enakih kopij ciljnega segmenta DNA: V procesu imenovanem podaljšanjese reakciji doda toplotno občutljiv encim TAQ polimeraza. Nato se reakcija segreje na 72 stopinj Celzija in aktivira encim. Aktivni encim DNA polimeraza se veže na začetnike in kopira zaporedje DNA med njimi. Začetni postopek zaporedja in kloniranja DNA je končan.

Povečanje donosa klonirane DNA: Začetni postopek žarjenja in podaljšanja ustvari razmeroma malo kopij razpoložljivih segmentov verige DNA. Za povečanje izkoristka z dodatno replikacijo DNA reakcijo ponovno ohladimo, da ponovno aktiviramo začetnike in pustimo, da se vežejo na druge verige DNA.

Nato ponovno segrevanje reakcije ponovno aktivira encim polimerazo in nastane več kopij. Ta cikel lahko ponovimo 25 do 30-krat.

Metoda vektorskega plazmida se opira na veliko začetno oskrbo z DNA, ki jo razrežemo in vstavimo v plazmide. Premalo izvirne DNA povzroči manj plazmidov in počasen začetek klonirane proizvodnje DNA.

Metoda PCR lahko proizvede veliko količino DNA iz nekaj originalnih verig DNA, toda ker DNA ni vsadljena v bakterijsko celico, proizvodnja beljakovin ni mogoča.

Za izdelavo beljakovin, kodiranih v fragmentih DNA, ki jih je treba klonirati iz majhnega začetnega vzorca DNA, lahko obe metodi uporabimo skupaj in dopolnjujejo. Najprej se s pomočjo metode PCR klonira DNA iz majhnega vzorca in ustvari veliko kopij.

Nato produkte PCR uporabimo s plazmidno vektorsko metodo za vsaditev proizvedene DNA v bakterijske celice, ki bodo proizvedle želene beljakovine.

Molekularna biologija uporablja kloniranje genov in razmnoževanje DNA v medicinske in komercialne namene. Bakterije s kloniranimi zaporedji DNA se uporabljajo za proizvodnjo zdravil in nadomeščanje snovi, ki jih ljudje z genetskimi motnjami ne morejo proizvesti sami.

Tipične uporabe vključujejo:

• Gen za humani inzulin je kloniran v bakterije, ki nato proizvajajo inzulin, ki ga uporabljajo diabetiki.
• Aktivator tkivnega plazminogena se proizvaja iz klonirane DNA in se uporablja za pomoč preprečujejo nastanek krvnih strdkov.
• Človeški rastni hormon lahko proizvajajo in dajejo ljudem, ki jih sami ne morejo proizvesti.

Biotehnologija uporablja tudi kloniranje genov v kmetijstvu, da ustvari nove značilnosti rastlin in živali ali izboljša obstoječe lastnosti. Ko se klonira več genov, se število možnih uporab eksponentno poveča.

Molekule DNA tvorijo majhen del materiala v živi celici in težko je izolirati vplive številnih genov. Metode kloniranja DNA prinašajo velike količine določenega zaporedja DNA za preučevanje in DNA proizvaja beljakovine, tako kot v prvotni celici. Kloniranje DNA omogoča samostojno preučevanje te operacije za različne gene.

Tipične aplikacije za raziskave in tehnologijo DNA vključujejo preučevanje:

• Delovanje gena.
• Mutacije gena.
• Izražanje genov.
• Genski izdelki.
• Genetske okvare.

Ko se klonira več zaporedij DNA, je lažje najti in klonirati dodatna zaporedja. Z obstoječimi segmenti klonirane DNA lahko določimo, ali se novi segment ujema s starim in kateri deli so različni. Takrat je identifikacija ciljne sekvence DNA hitrejša in natančnejša.

V genska terapija, klonirani gen je predstavljen celicam organizma, katerega naravni gen je poškodovan. Vitalni gen, ki proizvaja beljakovine, potrebne za določeno funkcijo organizma, bi lahko mutiral, spremenil sevanje ali vplival virus.

Kadar gen ne deluje pravilno, v celici manjka pomembna snov. Genska terapija poskuša zamenjajte gen s klonirano različico, ki bo proizvedla zahtevano snov.

Genska terapija je še vedno eksperimentalna in le malo bolnikov je bilo s to tehniko ozdravljenih. Težave so v prepoznavanju posameznega gena, ki je odgovoren za zdravstveno stanje, in dostavi številnih kopij gena pravim celicam. Ker je kloniranje DNA postalo vse bolj razširjeno, se genska terapija uporablja v več specifičnih situacijah.

Zadnje uspešne aplikacije so vključevale:

• Parkinsonova bolezen: Z uporabo virusa kot vektorja so vmesni možgani bolnikov vbrizgali gen, povezan s Parkinsonovo boleznijo. Bolniki so imeli izboljšane motorične sposobnosti brez kakršnih koli škodljivih stranskih učinkov.
• Pomanjkanje adenozin deaminaze (ADA): Genetsko imunsko motnjo so zdravili z odstranitvijo matičnih celic krvi bolnikov in vstavitvijo gena ADA. Kot rezultat so lahko bolniki proizvedli vsaj nekaj lastnega ADA.
• Hemofilija: Ljudje s hemofilijo ne proizvajajo specifičnih beljakovin, ki pomagajo pri strjevanju krvi. V jetrne celice bolnikov so vstavili gen za proizvodnjo enega od manjkajočih proteinov. Bolniki so proizvedli beljakovine in zmanjšali število primerov krvavitve.

Genska terapija je ena najbolj obetavnih aplikacij za kloniranje DNA, vendar se bodo druge nove uporabe verjetno razširile, saj se preučuje več zaporedij DNA in določa njihova funkcija. Kloniranje DNA daje surovino za genski inženiring v potrebnih količinah.

Ko je vloga genov znana in je njihovo pravilno delovanje mogoče zagotoviti z zamenjavo okvarjenih gene, številne kronične bolezni in celo raka je mogoče napasti in zdraviti na genetski ravni z uporabo DNK tehnologija.

Povezana vsebina:

• Značilnosti kolonije E.Coli (Escherichia Coli)
• RNA: opredelitev, funkcija, struktura