V molekularni biologiji je lahko dobra izbira pufra in priprava na različne korake izolacije DNA razlika med prehodom na izražanje beljakovin ali odpiranjem drugega kompleta za pripravo na začetek konec. Kljub ključni pomembnosti so vmesni recepti pogosto ravno to - recepti, napisani brez obrazložitve ali utemeljitve za različne sestavne dele. Takšen pufer je glukozni-tris-EDTA ali GTE pufer.
Za kaj se uporablja GTE?
GTE se uporablja za resuspendiranje pelet bakterijskih celic pred liziranjem (odpiranjem) celic in pridobivanjem plazmidne DNA znotraj. Poleg pufra GTE se pogosto doda lizocim, ki zmehča celične membrane. Doseganje homogene suspenzije celih celic med tem korakom, da lahko naknadno dodana raztopina za lizo pride do vseh celic, je ključnega pomena za doseganje dobrih donosov DNA. GTE je zasnovan za to, hkrati pa zagotavlja stabilno okolje za DNA.
Glukoza za osmolarnost
50mM (milimolarni) glukozni sladkor se doda v pufer GTE, da se ohrani osmolarnost, kadar je koncentracija topljene snovi zunaj celic blizu koncentracije znotraj celic. To preprečuje prezgodnjo lizo celic, ki lahko zaradi agregacije in razgradnje povzroči nižji donos DNA. Tudi druge komponente pufra prispevajo k osmolarnosti raztopine, toda glukoza, ker je ne-elektrolit, je dobra izbira, ker ne moti pufra raztopine lastnosti.
Tris za stabilnost pH
Tris je kratko ime za tris (hidroksimetil) aminometan, ki je zelo pogost pH pufer. V primeru pufra GTE se v pufer doda kisla sol (Tris-HCl) pri koncentraciji 25 mM. S tem se pH raztopine vzdržuje na skoraj fizioloških 8,0, kar je idealen pH za preprečevanje kisle hidrolize (razgradnje) plazmidne DNA in neželenih stranskih reakcij drugih komponent celic.
EDTA preprečuje razgradnjo DNA
EDTA ali etilendiamintetraocetna kislina zajame ali "kelatira" kovinske ione iz raztopine in jim prepreči sodelovanje v neželenih stranskih reakcijah. V medpomnilnik GTE se EDTA doda pri 10 mM. Njegov glavni namen je v puferju, da zaokroži prosti cink, magnezij in kalcij, s čimer preprečuje razgradnjo DNA po nekaterih poteh, ki zahtevajo te kovine.
Nekaj pomembnih nasvetov
Hranite svoj pufer GTE na hladnem in ga pripravite v majhnih količinah, da preprečite rast nenamernih bakterij v njem. Sladkor in nadzorovan pH omogočata odličen rastni medij. Vedno uporabljajte prečiščeno vodo. Voda iz pipe ima lahko presežek kovinskih ionov iz cevi, kar lahko premaga sposobnost EDTA, da zajame. Če sumite, da je v vzorcu moteča RNA, v oddajnik GTE dodajte RNazo A s 100 mikrogrami na mililiter, da odpravite težavo.
