Kako se zbere vzorec DNA in pripravi na študijo

Preden lahko DNK sekvencirajo ali spremenijo z genskim inženiringom, jo ​​morajo znanstveniki najprej izolirati. To se morda zdi težka naloga, saj celice vsebujejo številne druge spojine, kot so beljakovine, maščobe, sladkorji in majhne molekule. Na srečo lahko biologi uporabijo kemijske lastnosti DNK, da DNK ločijo od teh onesnaževalcev in jo pripravijo na nadaljnje študije. Ta postopek se imenuje ekstrakcija DNK.

Za ekstrakcijo DNA se uporablja veliko različnih tehnik. Tisti, ki ga uporablja posamezni laboratorij, je odvisen od vrste eksperimenta, ki ga je treba izvesti, in od tega, kako čista mora biti DNK. Znanstveniki običajno začnejo z vzorcem, ki vsebuje celice - na primer vzorec tkiva ali krvi, in razbijejo celice ali jih lizirajo. Obstajajo različni načini liziranja celic. Če dodate detergent, se bodo ločili, prav tako pa jih bodo podvrgli visokofrekvenčnim zvočnim valovom. Če vzorec zmešate s steklenimi kroglicami in ga hitro vibrirate, lahko celice fizično razbijete in sprostite njihovo vsebino.

Če ni potrebna visoka čistost, lahko znanstveniki dodajo encim, imenovan proteinaza K, da razgradijo večino beljakovin v vzorcu, nato pa ga uporabijo, kakršen je. Ta tehnika pa je zelo umazana, saj je večina onesnaževalcev še vedno prisotna, zato je primerna le, če je hitrost prednostna naloga in čistost ni pomembna. Drug hiter in umazan pristop je odstranjevanje beljakovin s povečanjem koncentracije soli z dodajanjem soli, kot sta amonijev ali kalijev acetat, da se beljakovine oborijo. Tudi ta tehnika je dokaj umazana, saj so še vedno prisotni številni drugi onesnaževalci.

Drug pristop je liziranje celic z detergentom, nato raztopino zmešamo z izoamil alkoholom, kloroformom in fenolom. Nato se raztopina loči v dve plasti. Beljakovine končajo v zgornji organski plasti, medtem ko DNA ostane v spodnji vodni plasti. Ta tehnika zahteva natančen nadzor koncentracije soli in pH za dobre rezultate. To je dolgotrajno, tako fenol kot kloroform sta zelo strupeni kemikaliji. Medtem ko so bile ekstrakcije fenol-kloroforma nekoč rutinske, so druge tehnike v zadnjih letih postale bolj priljubljene.

Anionsko-izmenjevalna kromatografija ponuja večjo čistost in bolj dosledne rezultate kot ekstrakcija fenol-kloroforma. Cev ali kolona je napolnjena z majhnimi delci, ki imajo na sebi pozitivno nabita mesta, kjer se lahko veže negativno nabita molekula ali anion. DNA se veže na ta mesta izmenjave anionov, medtem ko se drugi onesnaževalci, kot so beljakovine in RNA, izperejo iz kolone. Kasneje uporabimo raztopino, bogato s soljo, za izvlečenje DNA iz kolone.

Najhitrejša in morda najbolj zanesljiva tehnika za čiščenje DNK je uporaba posebej izdelanega kompleta. Ti kompleti vsebujejo membrane silikagela v cevi. DNA se prilepi na membrano, medtem ko se drugi onesnaževalci sperejo z vrsto posebej pripravljenih solnih raztopin, ki so priložene kompletu. Na koncu DNA s kolone speremo z raztopino z malo soli. Ti kompleti so hitri, enostavni za uporabo in ponujajo ponovljive rezultate.

Ko DNA izoliramo in resuspendiramo v pH-nadzorovani puferski raztopini, je zadnji korak preizkus njene čistosti. Enostaven in priročen način je, da preverite, koliko ultravijolične svetlobe absorbira pri valovni dolžini 260 in 280 nanometrov. Absorpcija pri 260 nanometrih, deljena z absorpcijo pri 280 nanometrih, mora biti enaka 1,8, če je DNA čista. Merjenje absorbance pri 260 nanometrih vam omogoča tudi določitev koncentracije DNA.