Genetski načrt celice je kodiran znotraj njenega genskega materiala ali DNA. Ker DNK nikoli ne zapusti jedra celice, da bi te informacije prišle v citoplazmo kjer koli drugje beljakovin in biokemičnih komponent, je treba najprej prepisati DNA v messenger RNA (mRNA ali poli (A) RNA). Ta mRNA se nato pretvori v beljakovine, ki izvajajo številne funkcije celice. Za odkrivanje ali kvantificiranje zelo redkih mRNA, izdelavo sond za mikromreže ali izdelavo knjižnic komplementarnih molekul DNA je treba mRNA izolirati. Vendar ekstrakcija celotne RNA (tj. Vsa RNA v celici) in nadaljnja izolacija mRNA nista medsebojno izključujoča se procesa; prvo je treba izvesti, da lahko ekstrahiramo mRNA.
Homogenizacija TRIzola: skupna RNA vključuje vso mRNA, prenosno RNA, ribosomsko RNA in druge nekodirajoče RNA. Da se te ločijo od drugih celičnih komponent, se celica najprej razpoči in sprosti vsebino. To se naredi z resuspendiranjem celic, peletiranih s centrifugiranjem (predenje pri visokih hitrostih) v reagentu TRIzol (Life Technologies). Druge različice TRIzola (na primer Ambionov reagent TRI) delujejo podobno.
Popolna izolacija RNA: Z vrsto centrifugiranja se različne komponente (beljakovine, DNA, RNA) celice ločijo na plasti ali faze znotraj suspenzije. Zgornja, rumeno obarvana faza je sestavljena iz maščobe in jo lahko zavržemo. Želena faza je obarvana rdeče, vsebuje celotno RNA in se zadrži. Po izvedbi ekstrakcije fenol-kloroforma in nizu alkoholnih izpiranj z izopropanolom in etanolom lahko RNA peletiramo za izolacijo mRNA. Dodajte zaviralce RNaze, da preprečite, da bi ta encim razgradil celotno RNA.
Ekstrakcija mRNA: Običajno je uporaba kompleta za izolacijo mRNA, saj domači laboratorijski protokoli ne ustvarjajo velikih količin visoko prečiščenih mRNA. Komercialni kompleti vključujejo Invitrogenov FastTrack 2.0 ali Ambion’s Poly (A) Pure mRNA Isolation Komplet. Ti osnovni koraki so skupni takim kompletom:
d) Ta vzorec centrifugiramo in pridobimo supernatant, ki ga večkrat izperemo v nizu veznih pufrov z nizko koncentracijo soli, ki so na voljo v kompletih.
Reference
- "Knjižnični protokoli cDNA?"; Ian G. Cowell in Caroline A. Austin; 1997
- "In vitro transkripcija in prevajalski protokoli?"; Martin J. Timme; 1995
Nasveti
- Vse reagente, celice in RNA ohladite s potopitvijo v led. To preprečuje, da bi RNA razgradili kateri koli drugi encimi, ki se sprostijo med postopkom homogenizacije.
Opozorila
- Reagenti, kot je TRIzol, so strupeni in ne smejo biti v stiku s kožo ali sluznico. Pri ravnanju s tem reagentom vedno upoštevajte varne laboratorijske protokole.
O avtorju
Palmer Owyoung je magistriral iz mednarodnega poslovanja na Kalifornijski univerzi v San Diegu in Diplomirani umetnik sociologije na Kalifornijski univerzi v Santa Barbari in je izobražen molekulec biolog. Od leta 2006 je svobodni pisatelj. Poleg tega, da piše, je redni trgovec s Forexom in prodajalec interneta.
Foto krediti
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images