Spektrofotometrija je neprecenljivo orodje v kemiji in biologiji. Osnovna ideja je preprosta: različne snovi absorbirajo svetlobo / elektromagnetno sevanje bolje pri nekaterih valovnih dolžinah kot pri drugih. Zato so nekateri materiali prozorni, drugi pa so na primer obarvani. Ko skozi raztopino posijete svetlobo dane valovne dolžine, večja je njena koncentracija, več svetlobe bo absorbirala. Če želite izračunati koncentracijo, morate primerjati svoje odčitke z odčitki za standarde znane koncentracije. Spodnji postopek je dokaj splošen postopek, napisan z mislijo na laboratorij za poučevanje kemije, vendar ga je mogoče spremeniti tudi za druge nastavitve.
Kot vedno pri delu v laboratoriju, si zagotovite očala, rokavice in plašč z dolgimi rokavi, da zagotovite svojo varnost.
Stisnite gumijasto žarnico, da jo izpraznite iz zraka, nato pa jo postavite na svojo merilno pipeto in pustite, da se žarnica sprosti, tako da vpije vodo v pipeto. Nato odstranite žarnico in zgornji del pipe zaprite s prstom; to bo zaprlo pipeto, tako da raztopina v notranjosti ne bo stekla, dokler ne odstranite prsta. Robu prsta rahlo dvignite, da iz pipete izteče malo raztopine, dokler ne dosežete želene glasnosti. Vadite z nekaj vode in čašo, da boste dobili občutek, kako deluje graduirana pipeta. Povezava v razdelku Viri vsebuje filmski posnetek, ki vam pokaže, kako uporabljati pipeto, če še nikoli niste delali z njo.
Označite 5 epruvet kot standarde 1-5. Označite jih lahko z lepilnim trakom in pisalom ali z oznako za suho brisanje.
Izberite pet koncentracij za svoje standarde. Želite, da so standardne koncentracije ločene med seboj v približno enakem intervalu - npr. 0,1 molarja, 0,2 molarja, 0,3 molarja itd. - in v približno enakem obsegu, kot pričakujete, da bo vaše neznano. Zaenkrat uporabite naslednjih pet koncentracij, vendar ne pozabite, da jih boste morali spremeniti med izvajanjem lastnega eksperimenta:
Standard 1: 0,1 molar Standard 2: 0,2 molar Standard 3: 0,3 molar Standard 4: 0,4 molar Standard 5: 0,5 molar
Nato vzemite 1 molsko standardno raztopino in dodajte naslednje količine v epruvete 1-5. Ne pozabite, da se te količine izračunajo z zgoraj navedenimi koncentracijami, zato jih boste morda morali po potrebi spremeniti med izvajanjem lastnega poskusa.
Standard 1: 0,8 mililitra Standard 2: 1,6 mililitra Standard 3: 2,4 mililitra Standard 4: 3,2 mililitra Standard 5: 4 mililitra
Izperite merilno pipeto in nato prenesite naslednje količine deionizirane vode:
Standard 1: 7,2 mililitra Standard 2: 6,4 mililitra Standard 3: 5,6 mililitra Standard 4: 4,8 mililitra Standard 5: 4,0 mililitra
V bistvu je ideja, da količina raztopine v vsaki epruveti doseže do 8 mililitrov.
Vsako standardno cev pokrijemo s parafilmom in obrnemo, da se premeša.
Označite še pet epruvet kot "Neznano 1-5." V vsako dodajte enako količino svoje neznane ali preskusne raztopine, kot ste jo uporabili z 1 molsko raztopino za standarde. Z drugimi besedami, neznani 1 bo vseboval 0,8 mililitra preskusne raztopine in 7,2 mililitra vode, neznano 2 bo vsebovalo 1,6 mililitra preskusne raztopine in 6,4 mililitra vode itd naprej.
Vsako neznanko pokrijemo s parafilmom in previdno obrnemo, da se premeša.
Vklopite spektrofotometer in pustite, da se ogreje. Potreben čas bo odvisen od modela in proizvajalca.
Na spektrofotometru nastavite valovno dolžino. Valovna dolžina je odvisna od vrste kemikalije v vašem poskusu. Za zdaj predpostavimo 500 nm, čeprav ne pozabite, da boste morali to spremeniti za različne poskuse.
Umerite spektrofotometer. Postopek umerjanja se razlikuje glede na napravo, ki jo uporabljate. Za Spectronic 20, ki je pogost model v učnih laboratorijih, boste najprej prilagodili stroj tako, da se glasi "0 odstotkov T" ko ni naložena nobena kiveta, jo prilagodite tako, da se glasi "100% T", če je prazna kiveta, ki vsebuje samo deionizirano vodo naložen. Ti postopki se lahko razlikujejo glede na vrsto naprave, ki jo uporabljate, zato podrobnosti preberite v navodilih proizvajalca.
Po kalibraciji naprave vzemite standardno 1 epruveto in vsebino prelijte v čisto kiveto, dokler ne doseže polnilne črte. Kiveto obrišite s krpo, da odstranite vse prstne odtise ali drugo umazanijo. Vstavite kiveto v spektrofotometer in zabeležite odčitek "% T".
Ta postopek ponovite za vseh 10 vzorcev. Bodite prepričani, da očistite kiveto med vzorci, da se prepričate, da so vaši rezultati čim bolj natančni.
Vzemite rezultate za svoje standarde in jih vnesite v preglednico / grafični program, kot sta Excel ali OpenOffice.
S programom za preglednice razdelite 100 odstotkov na vsako od vrednosti "% T" za standarde, nato zabeležite dnevnik rezultatov. Ta izračun vam bo dal vpojnost. Če vnesete formulo, bo program za preglednice naredil izračun namesto vas.
Primer: Če je% T 50,6, bi bila formula, ki jo vnesete v program za preglednice, naslednja:
dnevnik (100 / 50,6)
Program preglednic bo naredil aritmetiko.
Naredite enako za vseh pet neznanih / eksperimentalnih vrednosti.
Grafizirajte vrednosti absorbance za vseh pet standardov, s koncentracijo na osi x in absorpcijo na osi y. S pomočjo programa za preglednice na ta graf prilegajte linearno enačbo. Enačba bo v obliki y = mx + b. Večina programov za preglednice bo imela funkcijo linearne regresije. Za podrobnosti o uporabi funkcije linearne regresije si oglejte uporabniški priročnik za program preglednic.
Vzemite enačbo za najprimernejšo črto iz vašega programa za preglednice in jo rešite za y tako, da z obeh strani odštejete b in obe strani delite z m. Rezultat bo videti tako:
(y - b) / m = x
kjer sta b in m vrednosti, ki jih najde vaš program za preglednice.
Preverite vrednosti absorbance za neznanke in izberite tri, ki sodijo približno v isti obseg kot standardi. Te tri vrednosti absorbance uporabite za preostale izračune. Če vseh pet spada v isti obseg kot standardi, lahko namesto njih uporabite vseh pet, vendar morate uporabiti vsaj tri.
Namesto y vstavite vsako od treh vrednosti absorbance v svojo enačbo. Ne pozabite, da je bila vaša enačba v naslednji obliki:
(y - b) / m = x
Torej boste želeli v enačbo namesto y priključiti vrednost absorbance za vsako neznanko, nato pa izračunati x. S programom preglednic lahko ta izračun opravite namesto vas in ga pospešite. Zdaj ste izračunali koncentracijo kemikalije, ki vas zanima, v treh vaših razredčenih neznank. Prvotna raztopina je bila razredčena za pripravo teh neznank, zato morate zdaj delati nazaj in izračunati koncentracijo prvotne raztopine na podlagi faktorja redčenja.
Vsak neznan vzorec, ki ste ga vstavili v spektrofotometer, smo razredčili z drugačno količino. Zato bi morali zdaj koncentracijo, ki ste jo izračunali na podlagi absorbance za vsako neznano vrednost, razdeliti na naslednje:
Neznano 1: deljeno z 0,1 neznano 2: deljeno z 0,2 neznano 3: deljeno z 0,3 neznano 4: deljeno z 0,4 neznano 5: deljeno z 0,5
Ne pozabite pa, da te številke temeljijo na predpostavki, da uporabljate zgoraj opisane razredčitve. Ne pozabite spremeniti teh vrednosti, če ste vzorce razredčili z drugačno količino.
Rezultate dodajte skupaj in jih razdelite na število rezultatov. To vam bo dalo povprečje. Sporočite to številko kot svojo ugotovitev koncentracije prvotne raztopine.
Stvari, ki jih boste potrebovali
- Svinčnik
- Papir
- Kalkulator
- Rokavice
- Očala
- Plašč z dolgimi rokavi
- Spektrofotometer
- Steklene kivete
- Parafilm
- Kimwipes
- Deionizirana voda
- Raztopina, ki jo želite preizkusiti (neznane koncentracije)
- 1 molska standardna raztopina kemikalije v preskusni raztopini
- Diplomirana pipeta in žarnica
- Epruvete in stojalo za epruvete
- Čaša
Nasveti
Ta postopek se morda sliši zapleteno, vendar je po začetku dejansko dokaj enostaven. Poskusite si ogledati dva videoposnetka v razdelku Viri, da se seznanite s postopkom.