Biokemiki in molekularni biologi uporabljajo elektroforezo za ločevanje makromolekul, kot so beljakovine in nukleinske kisline. To omogoča znanstvenikom, da v kompleksni zmesi izolirajo in analizirajo posamezna zaporedja proteinov ali nukleinskih kislin. Tipičen primer elektroforeze v laboratoriju je mikrobiolog, ki uporablja verižno reakcijo s polimerazo (PCR) za ločevanje fragmentov DNA, proizvedenih v mikrobni skupnosti. Ne glede na namen elektroforeza vedno zahteva uporabo puferske raztopine.
TL; DR (predolgo; Nisem prebral)
Elektroforeza ločuje makromolekule, kot so beljakovine in nukleinske kisline, po velikosti, naboju in drugih lastnostih. Za elektroforezo, ki se ločuje po naboju, znanstveniki uporabljajo pufer za prenos tega naboja skozi gel. Pufer tudi ohranja gel pri stabilnem pH, kar zmanjšuje spremembe, ki bi se lahko pojavile v beljakovinah ali nukleinski kislini, če bi bile izpostavljene nestabilnemu pH.
Načela elektroforeze
Elektroforeza ločuje molekule vzdolž gradienta glede na njihovo velikost, naboj ali druge lastnosti. Ta gradient je lahko električno polje ali, v primeru elektroforeze z denaturacijskim gradientnim gelom (DGGE), denaturant, kot je mešanica sečnine in formamida. Beljakovine se bodo selile proti anodi, če je negativno napolnjena, in k katodi, če je pozitivno nabita. Ker se večje molekule selijo počasneje kot manjše, lahko znanstveniki izmerijo prevoženo pot in z logaritmi določijo velikost drobcev.
Denaturacijska gradientna elektroforeza v gelu
Z DGGE se DNK premika po gradientu naraščajoče denaturacijske moči, dokler moč ne zadošča za denaturiranje ali razkritje tega določenega fragmenta DNA. Na tej točki se migracija ustavi. Znanstveniki lahko s to metodo ločijo drobce glede na njihovo individualno dovzetnost za denaturacijo.
Kaj naredi pufer
V primeru elektroforeze, ki se ločuje na osnovi naboja, ioni v odbojniku prenašajo naboj, potreben za ločevanje. Pufer z rezervoarjem šibke kisline in baze tudi ohranja pH v ozkem območju. To je pomembno, ker se bosta struktura in naboj beljakovin ali nukleinske kisline spremenili, če bo izpostavljen pomembnim spremembam pH, kar bo preprečilo pravilno ločevanje.
Tipični odbojniki
Različni puferji so idealni za vzdrževanje gela za elektroforezo pri različnih želenih območjih pH. Značilni puferji, ki jih v ta namen uporabljajo znanstveniki, vključujejo ocetno kislino, borovo kislino, fosforno kislino in citronsko kislino ter glicin in tavrin. Na splošno mora biti vrednost pKa (disociacijska konstanta kisline) blizu zahtevanega pH. Za nas je bolj priporočljivo, da zagotavljajo nizko velikost naboja, da ne prevajajo preveč toka.