Pri delu z visoko zmogljivo tekočinsko kromatografijo (HPLC) je dobra kalibracija nujno potrebna za zagotovitev zanesljivih in kakovostnih rezultatov. Pravilna kalibracija instrumenta HPLC se začne z izdelavo ustreznega kalibracijskega standarda. V večini primerov kalibracija dejansko zahteva vrsto standardov naraščajoče koncentracije, da dobimo tako imenovano umeritveno krivuljo. To je narisana črta in z njo povezana enačba, ki opisuje razmerje med koncentracijo kemikalije, za katero se preskuša, in odzivom detektorja HPLC.
Določite kemikalijo, ki jo želite preizkusiti z uporabo HPLC ("analit"). Na primer, morda boste želeli preizkusiti vrsto brezalkoholnih pijač na vsebnost fruktoze, v tem primeru bi bila fruktoza analit.
Pridobite količino analita kemikalije primerne čistosti. Običajno mora biti čistoča nad 99%, analit pa je treba kupiti pri uglednem podjetju za dobavo kemikalij. V primeru fruktoze bi na primer čisto fruktozo kupili pri prodajalcu kemikalij in ne v trgovini.
Določite največjo in najmanjšo pričakovano koncentracijo analita v vzorcih, ki jih nameravate preskusiti s HPLC. Pri brezalkoholnih pijačah bi preučili nalepke pijač in med pijačami, ki jih boste testirali, določili najnižjo in najvišjo vsebnost fruktoze. Upoštevajte, da se lahko med pripravo na analizo začetni vzorec (brezalkoholna pijača) razredči ali kako drugače manipulira (odvisno od uporabljene metode HPLC) in tako je lahko koncentracija analita v dejansko vbrizganih vzorcih v HPLC spremenjen. Upoštevati je treba koncentracijo analita v vzorcih pri HPLC.
Določite topilo, v katerem boste raztopili analit, da sestavijo kalibracijske standarde. To topilo mora biti sposobno pravilno raztopiti analit v sorazmerno širokem območju koncentracije (vsaj tako visoko kot v vzorcih, ki jih nameravate testirati). Tudi topilo bi moralo biti v idealnem primeru precej podobno "mobilni fazi", topilu, ki se uporablja za prenos vzorcev skozi instrument HPLC.
Izračunajte količino analita, ki je potrebna za izdelavo "standardne" raztopine analita. To najdemo tako, da zahtevano koncentracijo osnovnega standarda pomnožimo z želeno prostornino. Koncentracija analita v tej raztopini mora biti vsaj 10% višja od najvišje predvidene koncentracije vzorca. Če je najvišja pričakovana koncentracija fruktoze v vzorcu brezalkoholnih pijač 8 gramov / 100 mililitrov, potem lahko osnovni standard dosežemo koncentracijo 10 gramov fruktoze / 100 mililitrov. Primerna količina je 500 mililitrov, zato bi bilo potrebno 8/100 ml x 500 ml = 40 gramov fruktoze.
Natehtajte zahtevano količino analita do ustrezne natančnosti. Pogosto je primerna utežna vrednost v gramih z natančnostjo na eno ali dve decimalni mesti, vendar je za nekatere metode morda potrebna večja natančnost.
Stehtani analit prenesemo v merilno bučko potrebne prostornine in dodamo želeno topilo na oznako za polnjenje na bučki. Uporaba merilne bučke (na primer namesto graduirane čaše) poveča natančnost vrednosti standardne koncentracije zaloge. Poskrbite, da se ves analit prenese v bučko; po potrebi uporabite nekaj topila, da ga sperete.
Naredite vrsto različnih razredčitev osnovnega standarda s prenosom znanih količin osnovnega standarda v merilne bučke z uporabo pipet za natančen prenos in nato dodajanjem topila. Najnižja standardna koncentracija mora biti pod najnižjo pričakovano analizo vzorca. V primeru brezalkoholnih pijač, če je najnižja pričakovana koncentracija fruktoze v vzorcu 2 grama / 100 ml, lahko dobimo standard 1 gram / 100 ml. To bi dosegli z desetkratno razredčitvijo osnovnega standarda. Standardna serija mora vsebovati skupno 5 ali 6 koncentracij, zato bi bila potrebna dodatna razredčenja, da se dobijo standardi 3, 5 in 8 gramov fruktoze / ml. Zdaj imate vrsto standardnih rešitev, s katerimi lahko umerite HPLC.