Chemici používajú na oddelenie zmesí zlúčenín vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu alebo HPLC. Metóda všeobecne spočíva v nastrekovaní vzorky do kolóny, kde sa zmieša s jedným alebo viacerými rozpúšťadlami. Rôzne zlúčeniny sa adsorbujú alebo „prilepia“ na stĺpec v rôznej miere; a keď rozpúšťadlo tlačí zlúčeniny cez kolónu, jedna zo zložiek zmesi najskôr vyjde z kolóny. Prístroj detekuje zlúčeniny pri výstupe z kolóny a vytvorí chromatogram, ktorý pozostáva z grafu s retenčným časom na osi x a intenzitou signálu z detektora na osi y. Keď zlúčeniny opúšťajú kolónu, vytvárajú na chromatograme „vrcholy“. Všeobecne platí, že čím ďalej od seba a čím sú vrcholy na chromatograme užšie, tým vyššie je rozlíšenie. Vedci považujú rozlíšenie 1,0 alebo vyššie za dostatočné oddelenie.
Zmerajte šírku dvoch susedných píkov na chromatograme tak, že si všimnete, kde sú hodnoty osi x na základni každého píku. Os x predstavuje retenčný čas, ktorý sa zvyčajne meria v sekundách. Ak teda vrchol začína o 15,1 sekundy a končí o 18,5 sekundy, jeho šírka je (18,5 - 15,1) = 3,4 sekundy.
Stanovte retenčné časy zaznamenaním času, t. J. Umiestnenia na osi x, ktoré zodpovedá umiestneniu maxima píkov. Táto hodnota bude zvyčajne približne v polovici medzi dvoma hodnotami použitými na výpočet šírky v kroku 1. Napríklad príklad uvedený v kroku 1 by vykazoval maximum okolo 16,8 sekundy.
Vypočítajte rozlíšenie R medzi dvoma vrcholmi podľa vzorca:
R = \ frac {RT_1-RT_2} {0,5 (W_1 + W_2)}
kde RT1 a RT2 predstavujú retenčné časy píkov 1 a 2 a W1 a W2 predstavujú šírky vrcholov prijatých na ich základniach. V pokračovaní príkladu z krokov 2 a 3 jeden vrchol vykazuje retenčný čas 16,8 sekundy a šírku 3,4 sekundy. Ak by druhý vrchol vykazoval retenčný čas 21,4 sekundy so šírkou 3,6 sekundy, potom by rozlíšenie bolo:
R = \ frac {21,4-16,8} {0,5 (3,4 + 3,6)} = 1,3
Veci, ktoré budete potrebovať
- HPLC chromatogram
- Kalkulačka