DNA
Kyselina deoxyribonukleová a bielkoviny. DNA je organizovaná do jednotiek nazývaných gény, z ktorých každý kóduje konkrétnu sekvenciu RNA alebo proteínu. Gény sa študujú s cieľom dozvedieť sa viac o biologickej štruktúre a funkcii, vývoji, chorobách a mnohých ďalších aspektoch živých systémov. Aby bolo možné podrobne študovať gény, musí sa DNA izolovať a vyčistiť zo záujmových buniek.
Extrakcia DNA
Aj keď sa dá DNA z jednej bunky extrahovať a študovať, nestačí ju vidieť voľným okom. Ak chcete získať dostatočné množstvo na cievkovanie, tým viac buniek musíte pracovať, tým lepšie (veľa miliónov).
Presné protokoly sa značne líšia, aby zohľadnili jedinečné vlastnosti konkrétnych vzoriek, ale všeobecnými krokmi sú homogenizácia, lýza, digescia, separácia a zber. Postup sa najlepšie vykoná v malej (v závislosti od veľkosti vzorky) sklenenej alebo plastovej skúmavky.
Vzorka sa obvykle zmieša alebo rozomelie, aby sa bunky navzájom dôkladne oddelili. Vďaka tomu sú bunkové zložky prístupnejšie pre nasledujúce činidlá. Potom sa k homogenátu pridá detergent alebo enzýmy na lýzu bunkových membrán (a jadrových membrán, ak sú bunky eukaryotické), aby sa uvolnila DNA. V tomto okamihu je DNA obklopená bielkovinami, lipidmi, sacharidmi a ešte všetkým, čo bolo v bunkách obsiahnuté.
Môže byť potrebné ďalšie enzymatické štiepenie, aby sa štiepili proteíny, aby sa neviazali na DNA a nezasahovali do jej zhromažďovania. DNA sa oddelí od zvyšku bunkového obsahu pridaním studeného, čistého, etylového alebo izopropylalkoholu. DNA nie je rozpustná v týchto alkoholoch, takže bude kondenzovať, aby sa pokúsila minimalizovať jej kontakt s alkoholom. Kondenzované DNA sa potom zhromaždili, zvyčajne centrifugáciou alebo navinutím.
Spooling DNA
Zber DNA spoolovaním je efektívny, keď sa z extrakcie získa veľké množstvo DNA. Je to tiež vynikajúca demonštračná metóda, pretože je jasne viditeľná pôsobivá spleť čistej DNA.
Na navinutie DNA sa musí separačný krok vykonať opatrne. Pokiaľ nebola súčasťou predtým pridanej zmesi lyzačného činidla, musí sa k roztoku pred krokom pridania alkoholu pridať koncentrovaný soľný roztok (chlorid sodný). Studený alkohol sa pomaly naleje po bočnej strane skúmavky, aby sa vytvorila vrstva na vodnom roztoku bez miešania. Ak sa to urobí správne, alkohol vytvorí na slanej vrstve svoju vlastnú vrstvu. Potom príde radenie.
Na zachytenie DNA zo slanej vrstvy opatrne položte cez alkoholovú vrstvu sklenenú miešaciu tyčinku, kým sa nedotkne dna skúmavky. Pomaly roztáčajte tyč medzi prstami a sledujte rozhranie medzi dvoma vrstvami. Ak je prítomné dostatok DNA, zhromaždí sa na rozhraní medzi vrstvami a vytvorí mliečne priesvitnú hmotu. Otočte tyč tak, aby okolo nej bola zabalená DNA (tj. Cievkovacia časť), a vytiahnite ju z skúmavky. DNA sa môže preniesť do inej skúmavky s čistým alkoholom na uskladnenie alebo ďalšiu analýzu.