Gélová elektroforéza je bežne používaná laboratórna technika s mnohými praktickými aplikáciami vrátane snímania prstov DNA a sekvenovania genómu. Tento proces zahŕňa oddelenie DNA fragmenty pomocou elektrického prúdu pri sledovaní rýchlosti molekulárneho pohybu cez filtračný gél.
Pridanie modrého alebo oranžového sledovacieho farbiva do bezfarebných vzoriek DNA vám umožní vidieť vašu vzorku a získať informácie o tom, ako sa molekuly DNA pohybujú počas elektroforézy. Identifikácia je založená na veľkosti pásov DNA na géli po migrácii molekúl.
Ako funguje gélová elektroforéza
Gélová elektroforéza ťahá fragmenty DNA cez gél pomocou elektrického prúdu na izoláciu a identifikáciu molekúl DNA podľa veľkosti a elektrického náboja. Gél sa často vyrába s agarózový prášok - polysacharid extrahovaný z morské riasy.
Agaróza sa pridá do tlmivého roztoku vody a soli a zmes sa zahreje a ochladí, aby sa vytvoril pórovitý gél, ktorý bude pôsobiť ako filtračná matrica počas postupu elektroforézy. Gél sa potom vloží do elektroforetickej jednotky a pokryje vodivým pufrovacím roztokom elektrina.
Roztoky obsahujúce DNA a nanášacie farbivá sa napipetujú do malých jamiek v géli, ktoré sa musia pripraviť počas prípravy gélu. Farbivápomôcť tijasne vidieť vzorku ktoré pridávate do gélových jamiek umiestnených v blízkosti zápornej elektródy jednotky na elektroforézu.
Kladná elektróda je umiestnená na opačnom konci. Do prvej jamky sa umiestni známy štandard fragmentov DNA, ktorý vytvorí rebrík pásov DNA na účely porovnania a identifikácie.
Fosfátový hlavný reťazec molekúl DNA dáva DNA negatívny náboj. Protiklady sa priťahujú, takže molekuly DNA sú priťahované k kladnej elektróde a pri zapnutí elektrického prúdu sa začnú pohybovať alebo „migrovať“.
Fragmenty DNA menšej veľkosti cestujú rýchlejšie ako väčšie fragmenty, pretože pri migrácii cez pórovitú matricu gélu narážajú na menší odpor. Fragmenty DNA podobnej veľkosti tvoria pásy DNA v géli.
Načítanie účelu a dôležitosti farbiva
DNA je bezfarebná, takže pridávanie stopové farbivá na vzorku ti pomôže určiť rýchlosť pohybu rôznych veľkostí proteínových molekúl v géli počas elektroforézy. Medzi príklady nanášacích farbív, ktoré sa pohybujú so vzorkou DNA, patria brómfenolModrá a xyléncyanol.
Zvolené farbivo by nemalo byť reaktívne ani meniť DNA. Bromofenolová modrá je farbivo používané na sledovanie menších reťazcov DNA, ktoré obsahujú asi 400 párov báz, zatiaľ čo xylén-kyanol je lepší pre väčšie reťazce DNA s až 8 000 pármi báz. Zvolené farbivo by nemalo byť reaktívne ani meniť DNA.
Úloha glycerolu v elektroforéze na agarózovom géle
Keď pripravujete svoju vzorku DNA na elektroforéza, budete musieť pridať glycerol a vodu spolu so nanášacími farbami. Glycerol je ťažká, sirupovitá látka, ktorá dodáva vzorke DNA väčšiu hustotu pred vložením do jamiek na jednom konci gélového listu.
Bez glycerolu by sa vzorka DNA rozptýlila namiesto toho, aby sa ponorila a vytvorila vrstvu v jamke, ako by to malo urobiť, aby sa vytvoril rebrík DNA.
Sledovanie farbiva na SDS STRANE
Gélová elektroforéza s dodecylsulfátom sodným na polyakrylamide (SDS PAGE) je technika vhodná na separáciu proteínov a aminokyselín, ktoré sú menšie a zložitejšie ako lineárne molekuly DNA. Na elektroforézu sa namiesto agarózového gélu použije polyakrylamid (gél SDS PAGE).
Bromofenolová modrá (BPB) sa pridá do tlmivého roztoku pre vzorky ako a stopovacie farbivo ktorý sa pohybuje rovnakým smerom oddeľovania proteínov a vymedzuje ich nábežnú hranu.
Úloha farbiva viažuceho DNA
DNA-viažuce farbivo ako napr oranžová farba etídiumbromid sa môže pridať na gél alebo do elektroforetického tlmivého roztoku. Ako naznačuje názov, farbivo sa viaže na molekulu DNA.
Pri manipulácii s týmto mutagénnym farbivom musíte postupovať veľmi opatrne, pretože sa môže viazať na DNA v kožných bunkách. Na rozdiel od stopových farbív, etídiumbromid fluoreskuje jasne pod UV svetlo, čím sa zviditeľnia pásy DNA.