Podľa webovej stránky BioWeb University of Wisconsin je PCR primer krátky syntetický oligonukleotid (zvyčajne medzi 18 dlhý až 25 báz) používaný na amplifikáciu špecifických oblastí DNA v technike molekulárnej biológie známej ako polymerázová reťazová reakcia (PCR). Je potrebný priamy aj reverzný primer navrhnutý tak, aby reverzne dopĺňal reťazec DNA, aby lemoval a viazal sa na požadovanú oblasť DNA. Keď chcú vedci vykonať výskum na konkrétnom géne alebo oblasti DNA, musia najskôr vykonať PCR, aby získali dostatok cieľovej oblasti na prácu. Môže byť potrebné navrhnúť sekvencie primerov pre oblasť záujmu, ak nie sú dostupné prostredníctvom skôr publikovaného výskumu alebo komerčných prostriedkov.
Získajte nukleotidovú sekvenciu požadovaného génu alebo DNA a rozhodnite sa, ako dlho chcete fragment amplifikovať. Priamy a spätný primer je navrhnutý tak, aby sa viazali na začiatku a na konci požadovaného fragmentu. Bežné metódy PCR typicky používajú priméry, ktoré ohraničujú oblasť dlhú od 100 do 1 000 párov báz, zatiaľ čo metódy PCR v reálnom čase používajú fragmenty dlhé asi 50 až 200 párov báz.
Rozhodnite sa, kde v poradí chcete, aby priméry ležali. Môžete napríklad chcieť umiestnenie v blízkosti 5 'alebo 3' konca sekvencie alebo v strede. Ak je to žiaduce, určte umiestnenie primerov, ktoré sa rozkladajú na intróne.
Dizajnovo pripravte základný náter s dĺžkou 18 až 24 báz. Vincent R. Prezioso, Ph. D., od Brinkmann Instruments Inc. naznačuje, že táto dĺžka je dostatočne dlhá na to, aby bola extrémne špecifická pre požadovanú oblasť DNA, ale dostatočne krátka na to, aby sa ľahko viazala (hybridizovala). Teplota topenia základného náteru (Tm) by mala byť medzi 55 až 80 stupňami Celzia, dostatočne nízka na to, aby umožnila úplné roztavenie pri teplote 90 ° C alebo viac, ale dostatočne vysoká na to, aby umožnila žíhanie. Obsah GC (percento Gs a Cs v poradí) by mal byť medzi 40 a 60 percentami. 3 'koniec sekvencie priméru by mal končiť v C alebo G (nazývanom GC svorka), aby sa podporilo viazanie, pretože G a C nukleotidy majú silnejšie väzby, vyvarujte sa však toho, aby ste mali v posledných piatich bázach sekvencie tri alebo viac Gs alebo Cs.
Nepoužívajte štyri alebo viac bázy jednej bázy (napríklad ACCCC ...) alebo štyri alebo viac dvoj nukleotidových opakovaní (napríklad ATATATAT ...), pretože by to mohlo spôsobiť nesprávnu formuláciu. Navrhnite priméry bez homológie medzi primérmi (viac ako tri bázy, ktoré sa komplementujú v jednej samotný primér) alebo homológia medzi primérmi (kde sa priamy a reverzný primer navzájom dopĺňajú sekvencie). To môže spôsobiť samo-diméry alebo primer-diméry, kde sa priméry viažu na seba namiesto väzby na požadovanú sekvenciu DNA.
Využite online zdroje a webové stránky, ktoré pomáhajú pri návrhu primérov, alebo pomáhajú kontrolovať sekvencie primérov, či nie sú komplementárne alebo či nie sú potenciálne schopné vytvárať sekundárne štruktúry, napríklad sponky do vlasov. Niektoré webové stránky s návrhmi primérov zahŕňajú Primer3 Massachusetts Institute of Technology, Primer-Blast z National Center for Biotechnology Information a OligoAnalyzer od Integrated DNA Technologies.