Tris alebo tris (hydroxymetyl) aminometán je bežný biologický pufor, ktorý sa používa v procese extrakcie DNA. Počas extrakcie z rôznych zdrojov je DNA citlivá na pH. Počas lýzy buniek, odstraňovania nežiaducich bunkových zložiek a zrážania sa na udržanie stabilného pH používa tris. Ďalej hrá obzvlášť dôležitú úlohu pri lýze buniek.
TL; DR (príliš dlhý; Nečítali)
Extrakcia DNA je proces citlivý na pH a použitie tlmivého roztoku tris pomáha udržiavať stabilné pH pri lýze a extrakcii buniek.
Tris ako nárazník
Pretože pH môže ovplyvňovať a byť ovplyvňovaných mnohými bunkovými faktormi, je pre experimentálnu vedu nevyhnutné udržiavať stabilné pH. Biologické pufre, ako napríklad tris, sú dôležité, pretože dokážu udržiavať stabilné pH aj napriek vplyvom, ktoré by inak mohli pH meniť. Tris (hydroxymetyl) aminometán s pKa 8,1 je efektívnym tlmivým roztokom medzi pH 7 a 9. Vďaka svojmu neutrálnemu rozsahu je tris bežne používaným tlmivým roztokom v biologických laboratóriách. Avšak tlmivý roztok tris je citlivý na teplotu a mal by sa používať pri teplote, pri ktorej bol pôvodne pH nastavený, aby sa zabránilo nepresnosti.
Lýza buniek
Lýza alebo rozbitie buniek je prvým krokom extrakcie DNA. Toto je dosiahnuté pufrom obsahujúcim tris a EDTA (kyselina etyléndiamíntetraoctová). EDTA viaže dvojmocné katióny, ako je vápnik a horčík. Pretože tieto ióny pomáhajú udržiavať integritu bunkovej membrány, ich eliminácia pomocou EDTA destabilizuje membránu. Tris je hlavná medzipamäťová zložka; jeho hlavnou úlohou je udržiavať pH pufra na stabilnom mieste, zvyčajne 8,0. Dodatočne tris pravdepodobne interaguje s LPS (lipopolysacharidom) v membráne a slúži na destabilizáciu membrány ďalej.
Tris Chráni DNA pred zmenami pH
Keď sa bunky rozpadnú, ich DNA a obsah sa vylejú do pufra. Ďalej sú často zahrnuté RNáza A (ničí RNA), proteázy (ničí proteíny) a SDS (dodecylsulfát sodný, solubilizuje fragmenty membrány). Dohromady táto polievka s bunkovým obsahom a fragmentovanou RNA a proteínmi môže mať veľký vplyv na pH roztoku. Pretože DNA je citlivá na pH, je dôležité, aby tris tlmila polievku a udržiavala pH na stabilnom mieste.
Zrážky DNA
V poslednej fáze extrakcie DNA sa z roztoku extrahuje samotná DNA. V tomto okamihu je DNA rozpustná v pufri. Na extrakciu z roztoku je DNA nerozpustná pridaním etanolu alebo izopropanolu (izopropylalkoholu). Keď je to hotové, DNA je v roztoku zrejmá ako biela vláknitá látka. Aj keď sa DNA môže izolovať zo zvyšných bunkových zložiek týmto spôsobom, nie je „použiteľná“, ak je nerozpustná. Po izolácii sa alkohol odstráni a DNA sa musí vrátiť do biologického pufra, ako je tris, ktorý sa má použiť.
Urob si sám
Aj keď sa extrakcia DNA vo výskumných laboratóriách bežne vykonáva pomocou jedného z mnohých komerčne dostupné súpravy môže ktokoľvek vykonať extrakciu DNA doma pomocou bežných domácich predmetov a zelenej farby hrášok alebo špenát. V takom prípade nie je prítomný tris ani žiadny biologický pufer, ktorý by chránil DNA pred zmenami pH. Je to však vizuálny spôsob, ako pomôcť študentom spojiť sa s bunkovou DNA.