Genetický plán bunky je zakódovaný v jej genetickom materiáli alebo DNA. Pretože DNA nikdy neopúšťa jadro bunky, aby sa tieto informácie dostali do cytoplazmy, kde sú iné prebývajú proteíny a biochemické zložky, je potrebné najskôr transkribovať DNA na messenger RNA (mRNA alebo poly (A) RNA). Táto mRNA sa potom translatuje na proteíny, ktoré vykonávajú mnoho funkcií bunky. Na detekciu alebo kvantifikáciu veľmi zriedkavých mRNA je potrebné izolovať mRNA, vytvoriť sondy pre mikročipy alebo vytvoriť knižnice komplementárnych molekúl DNA. Extrakcia celkovej RNA (t. J. Všetka RNA v bunke) a následná izolácia mRNA však nie sú vzájomne sa vylučujúce procesy; prvé sa musí vykonať, aby sa mohla extrahovať mRNA.
Homogenizácia TRIzol: Celková RNA zahŕňa všetky mRNA, prenosovú RNA, ribozomálnu RNA a ďalšie nekódujúce RNA. Aby sa oddelili od ostatných bunkových zložiek, je bunka najskôr otvorená, aby ju uvoľnila obsah. To sa deje resuspendovaním buniek peletovaných centrifugáciou (odstreďovaním pri vysokých rýchlostiach) v reagencii TRIzol (Life Technologies). Podobne fungujú aj ďalšie verzie TRIzolu (napríklad Ambion’s TRI Reagent).
Izolácia celkovej RNA: Na oddelenie rôznych zložiek (proteíny, DNA, RNA) bunky do vrstiev alebo fáz v suspenzii sa používa rad centrifugácií. Horná, žlto sfarbená fáza je zložená z tuku a môže sa vyhodiť. Požadovaná fáza je sfarbená do červena, obsahuje celkovú RNA a je zachovaná. Po uskutočnení extrakcie fenol-chloroformom a sérii premytí alkoholom s použitím izopropanolu a etanolu možno RNA peletovať na izoláciu mRNA. Pridajte inhibítory RNázy, aby ste zabránili tomu, aby tento enzým degradoval celkovú RNA.
Extrakcia mRNA: Na izoláciu mRNA je bežné používať súpravu, pretože domáce laboratórne protokoly negenerujú veľké množstvo. vysoko purifikovaných mRNA. Komerčné súpravy zahŕňajú Invitrogen’s FastTrack 2.0 alebo Ambion’s Poly (A) Pure mRNA Isolation Súprava. Pre tieto súpravy sú spoločné tieto základné kroky:
d) Táto vzorka sa centrifuguje a získa sa supernatant, ktorý sa niekoľkokrát premyje sériou väzbových a tlmivých roztokov s nízkym obsahom soli poskytnutých v súpravách.
Referencie
- "Protokoly z knižnice cDNA?"; Ian G. Cowell a Caroline A. Austin; 1997
- "Protokoly prepisu a prekladu in vitro?"; Martin J. Tymms; 1995
Tipy
- Všetky reagencie, bunky a RNA uchovávajte studené ponorením do ľadu. To zabraňuje degradácii RNA akýmikoľvek inými enzýmami, ktoré sa uvoľňujú počas procesu homogenizácie.
Varovania
- Činidlá, ako je TRIzol, sú toxické a nesmú byť v kontakte s pokožkou alebo sliznicami. Pri manipulácii s týmto reagentom vždy dodržujte bezpečné laboratórne protokoly.
O autorovi
Palmer Owyoung je držiteľom titulu Master of Arts v medzinárodnom obchode na Kalifornskej univerzite v San Diegu a Bakalár umenia v sociológii na Kalifornskej univerzite v Santa Barbare a je vyštudovanou molekulou biológ. Od roku 2006 je spisovateľom na voľnej nohe. Okrem písania sa venuje obchodovaniu na Forex-e na plný úväzok a internetovému marketingu.
Fotoúvery
Jupiterimages / Photos.com / Getty Images