Ako je DNA vizualizovaná pomocou gélovej elektroforézy?

Gélová elektroforéza je technika, ktorá umožňuje analýzu DNA na úrovni molekúl, z ktorých sa skladá. Pri tejto metóde vizualizácie DNA sa vzorky umiestnia na agarózové gélové médium a na gél sa aplikuje elektrické pole. To spôsobuje, že fragmenty DNA migrujú gélom rôznymi rýchlosťami v súlade s ich elektrochemickými vlastnosťami.

Etídiumbromid

Pre túto vizualizačnú techniku ​​sa etídiumbromid zmieša s agarózovým práškom, pufrom EDTA a vodou, aby sa pred elektroforézou vytvorila gélová matrica. Vo výsledku sa molekuly etídiumbromidu rovnomerne dispergujú v matrici. Po naplnení jamiek gélu príslušnými vzorkami DNA a stopovými farbivami sa použije napätie, ktoré pomaly privedie veľké polárne zlúčeniny cez matricu.

Počas tohto pohybu sa základy molekúl DNA dočasne viažu na častice vďaka náplni etídiumbromidu a tiahnu ich s sebou. Po dokončení gélovej elektroforézy každá molekula DNA zachytila ​​významné množstvo etídiumbromidu.

V prítomnosti ultrafialového svetla vykazuje etídiumbromid fluorescenciu. Technici svietia cez gél špeciálne kalibrovaným UV svetlom, zatiaľ čo prístroj sníma obrázky žiariacich úlomkov.

Metylénová modrá

Ak nie je UV transiluminátor k dispozícii alebo je praktický, technici môžu za normálnych podmienok zviditeľniť DNA namočením hotového agarózového gélu s elektroforézovanou DNA vo vnútri do roztoku metylénovej modrej cez noc.

Chloridová soľ s výrazne hydrofóbnym aniónom, molekuly metylénovej modrej prenikajú celou gélovou matricou. Avšak vodíková väzba v celej DNA spôsobuje hromadenie molekúl škvŕn. Táto zvýšená hustota zafarbenia DNA poskytuje hlbší odtieň modrej farby viditeľný voľným okom.

Sledovacie farbivá

Okrem relatívnej veľkosti pásov DNA môžu technici merať absolútnu veľkosť (v pároch báz) každého fragmentu pomocou chemikálií nazývaných stopovacie farbivá. Viditeľné bez pridania metylénovej modrej alebo etídiumbromidu sa stopové farbivá, ako sú brómfenolová modrá a xylénkylalkohol, pohybujú cez aragózové gélové matrice počas elektroforézy rovnakou rýchlosťou ako fragmenty DNA pozostávajúce z 300 nukleotidov a 4 000 nukleotidov, resp. Pri elektroforéze cestujú masívnejšie fragmenty DNA cez gélovú matricu pomalšie ako menšie fragmenty. Preto aj keď stopové farbivá priamo neovplyvňujú viditeľnosť fragmentov DNA, porovnanie polohy fragmentu DNA v géli do polohy týchto farbív umožňujú technikom „vidieť“ približný počet nukleotidov fragmentu DNA obsahuje.

  • Zdieľam
instagram viewer