Gélová elektroforéza na dodecylsulfát-polyakrylamid sodný (SDS-PAGE) je biochemická metóda identifikácie proteínov v roztoku. Ako ilustrujú Mathews a kol. V „Biochemistry“, „proteínové vzorky sa najskôr plnia do„ jamiek “alebo otvorov na jednom konci polyakrylamidového gélového bloku. Potom sa na gél aplikuje elektrické pole. SDS, pridaný k naplneným vzorkám, vylučuje prirodzený náboj bielkovín. Z tohto dôvodu samotná molekulová hmotnosť proteínu určuje rýchlosť migrácie proteínov pri ich pohybe cez gél smerom k kladne nabitému pólu, uvádza Bitesize Bio. Viac proteínov v tej istej vzorke sa preto od seba oddelí a migrujú do rôznych pozícií.
Orientujte gélovú fotografiu. „Na vrchu“ je umiestnenie jamiek, do ktorých boli pôvodne pridané vzorky. „Dno“ je miesto, kde vzorky migrovali smerom k a najčastejšie obsahujú prednú časť farbiva, ktorá označuje migrujúcu prednú časť vzoriek. Ľavá alebo pravá strana by mala obsahovať „marker“ používaný ako predvídateľný sprievodca molekulovou hmotnosťou.
Označte vzorky pre každý jazdný pruh. V hornej časti budú vzorky pridané do jamiek migrovať vertikálne v „pruhoch“. Preto všetky pruhy viditeľné vo vertikálnom stĺpci pochádzali z jednej vzorky načítanej priamo nad ním. Pomocou pravítka a pera umiestnite hranice na pruhy, ak je ťažké zobraziť stĺpce.
Označte molekulové veľkosti pruhov v pruhu markerov. Komerčne dostupné markery prichádzajú s obrázkom vzoru pásu, ktorý sa dá očakávať, spolu s molekulovými hmotnosťami každého pásma. Pásy sú tmavé horizontálne „pruhy“, ktoré sú v skutočnosti zafarbeným proteínom zabudovaným do gélu.
Nakreslite svetlé vodorovné čiary vedúce od každého označovacieho prúžku k opačnému okraju gélu. Dávajte pozor, aby boli tieto čiary rovnobežné s jamkami a pred farbou. Tieto čiary označujú, kde by sa proteíny s molekulovou hmotnosťou indikovanou každým z pásov markerov nachádzali v každej dráhe. Napríklad pásmo v jazdnom pruhu 4, ktoré sa nachádza tesne pod čiarou predĺženou z 25 kilodaltonov značkovacie pásmo naznačuje, že pás 4. pruhu má molekulárnu veľkosť takmer ale nie celkom 25 kilodaltonov váha.
Každý pás v každej dráhe označte jeho odhadovanou molekulovou hmotnosťou. Značky používajte ako pomôcku a odhadujte hodnoty medzi veľkosťami značiek.
Pod gélovú fotografiu urobte zoznam „bielkovín“ pre každý jazdný pruh. Na úvod uveďte, čo je o každej vzorke známe, napríklad jej pôvod alebo podmienky. Potom uveďte odhadovanú molekulovú hmotnosť každého pásma v jazdnom pruhu. Dráhy s jedným pruhom naznačujú, že vzorka obsahuje iba jeden proteín. Dráhy s viacerými pásmi naznačujú prítomnosť viacerých proteínov. Pásy, ktoré bežia s migračným frontom, sú menšie, ako navrhuje najbližšia značka, a pravdepodobne ich nemožno predvídať, iba ak je značka menšia ako značka.
V zozname bielkovín si všimnite zvláštnosti. „Rozmazaný“ vzhľad môže naznačovať, že je prítomných príliš veľa proteínov alebo že viskozita vzorky ovplyvnila jej migráciu. Ak sa zdá, že pásy presahujú okraj pruhu alebo sú v porovnaní s inými pásmi dosť veľké, potom je pravdepodobne koncentrácia tohto proteínu príliš vysoká a mala by sa v budúcnosti zriediť elektroforéza. Sivastý odtieň v celej jazdnej pruhe, tmavší ako farba gélu na pozadí, naznačuje nerozoznateľné fragmenty bielkovín.
Určte identitu proteínov v každej dráhe. Aj keď sa to deje iba s molekulovou hmotnosťou, zdroj každého pruhu pravdepodobne bude tiež naznačovať stopy. Zvážte, že za určitých podmienok si môžu proteíny udržiavať na géli asociáciu diméru alebo triméru. Jeden proteín sa preto môže na géle javiť ako tri odlišné pásy. Aj keď proteíny nie je možné identifikovať, relatívna tmavosť pásov môže znamenať koncentrácie proteínov v roztoku. Akékoľvek zvedavé a neznáme proteíny je možné izolovať priamo z pôvodného gélu a odoslať na identifikáciu.
Veci, ktoré budete potrebovať
- Fotografia zafarbeného gélu SDS-PAGE
- Kľúč pre použitý marker molekulovej hmotnosti
- Vládca
- Pero