Клеточные мембраны состоят из фосфолипидов и прикрепленных или встроенных белков. Мембранные белки играют жизненно важную роль в метаболизме и жизни клетки. Вы не можете использовать обычную микроскопию для визуализации или характеристики белков адгезии, транспортных белков и белковых каналов в клеточной мембране. Используя электронную микроскопию и метод, называемый «разрыв замораживания», при котором мембраны замороженных клеток разделяются на части, позволяет визуализировать структуру мембраны и организацию белков в море фосфолипиды. Сочетание других методов с замораживанием не только помогает нам понять структуру различных клеточных мембран и мембранных белков, но позволяет визуализировать и детально анализировать функции определенных белков, бактерий и вирусы.
Основные шаги при замораживании перелома
Используя жидкий азот, образцы биологических тканей или клетки быстро замораживаются для иммобилизации компонентов клеток. Клеточные мембраны состоят из двух слоев фосфолипидов, называемых бислоем, где гидрофобные или ненавидящие воду липидные хвосты указывают на внутренняя часть мембраны, а гидрофильные или водолюбивые концы липидной молекулы направлены наружу и внутрь клетка. Замороженный образец растрескивается или ломается с помощью микротома, который представляет собой похожий на нож инструмент для разрезания тонких срезов ткани. Это заставляет клеточную мембрану разделяться точно между двумя слоями, потому что притяжение между гидрофобными липидными хвостами является самым слабым местом. После разрушения образец подвергается вакуумной процедуре, называемой «травление замораживанием». Поверхность излома образец затенен парами углерода и платины, чтобы создать стабильную копию, которая повторяет контуры трещины самолет. Кислота используется для разложения органического материала, приставшего к реплике, оставляя тонкую платиновую оболочку на сломанной поверхности мембраны. Затем эта оболочка анализируется с помощью электронной микроскопии.
Замораживание травления
Травление замораживанием - это вакуумная сушка нефиксированного, замороженного или поврежденного замораживанием биологического образца. Процедура вакуумной сушки аналогична сублимационной сушке фруктов и овощей, которые упаковываются и продаются в продуктовых магазинах. Без замораживания многие детали ячеистой структуры закрываются кристаллами льда. Этап глубокого травления или травления замораживанием улучшает и расширяет первоначальный метод разрушения замораживанием, позволяя наблюдать за клеточными мембранами во время различных действий. Он позволяет анализировать не только структуру мембраны, но и внутриклеточные компоненты. и предоставляет подробную структурную информацию о бактериях, вирусах и крупном клеточном белке. комплексы.
Электронная микроскопия
Электронная микроскопия может выявить и увеличить более чем в миллион раз мельчайшие организмы или структуры, такие как бактерии, вирусы, внутриклеточные компоненты и даже белки. Визуализация создается путем бомбардировки ультратонкого образца пучком электронов. Двумя методами электронной микроскопии являются сканирующая электронная микроскопия, или SEM, и просвечивающая электронная микроскопия, или TEM. Образцы замороженных трещин обычно анализируются с помощью ПЭМ. TEM имеет лучшее разрешение, чем SEM, и предлагает структурную информацию с точностью до 3 нанометров реплик.
Выявление структуры клеточной мембраны
Разработка и использование электронной микроскопии разрушения при замораживании показало, что клеточные плазматические мембраны состоят из липидных бислоев, и прояснило, как белки организованы внутри клеточных мембран. Разрушение при замораживании дает уникальный взгляд на внутреннюю часть клеточных мембран, потому что он расщепляет и разделяет мембранные фосфолипиды на два противоположных и взаимодополняющих листа или поверхности. Спустя более 50 лет, прошедших с момента появления первой машины для разрушения замораживанием, изготовление платиновой копии по-прежнему остается единственным способом получить структурную информацию о клеточной мембране. Этот метод показывает, плавают ли определенные белки или закреплены в клеточной мембране, а также собираются ли и как некоторые белки. Более новый метод - использование антител, нацеленных на определенные белки - сочетается с замораживанием перелома для идентификации белков и их функций в клеточной мембране.