В молекулярной биологии хороший выбор буфера и подготовка к различным этапам выделения ДНК могут быть разница между переходом к экспрессии белка или открытием другого набора для макси-препарирования, чтобы начать над. Несмотря на свою решающую важность, рецепты буферов часто представляют собой просто рецепты, написанные без объяснения или обоснования различных компонентов. Одним из таких буферов является буфер глюкоза-трис-ЭДТА или GTE.
Для чего используется GTE?
GTE используется для ресуспендирования осадка бактериальных клеток перед лизированием (вскрытием) клеток и сбором плазмидной ДНК внутри. Лизоцим, смягчающий клеточные мембраны, часто добавляют вместе с буфером GTE. Достижение гомогенной суспензии целых клеток на этом этапе, чтобы добавленный впоследствии раствор для лизиса мог попасть ко всем клеткам, является ключом к получению хороших выходов ДНК. GTE предназначен для этого, а также обеспечивает стабильную среду для ДНК.
Глюкоза для осмолярности
50 мМ (миллимолярный) глюкозный сахар добавляют в буфер GTE для поддержания осмолярности, при которой концентрация растворенного вещества вне клеток близка к концентрации внутри клеток. Это предотвращает преждевременный лизис клеток, который может вызвать снижение выхода ДНК из-за агрегации и деградации. Другие компоненты буфера также влияют на осмолярность раствора, но глюкоза, не является электролитом, это хороший выбор, потому что он не влияет на буфер раствора. характеристики.
Трис для стабильности pH
Трис - это краткое название трис (гидроксиметил) аминометана, который является очень распространенным pH-буфером. В случае буфера GTE к буферу добавляют кислотную соль (Трис-HCl) в концентрации 25 мМ. Это поддерживает pH раствора на уровне, близком к физиологическому 8,0, идеальному pH для предотвращения кислотного гидролиза (деградации) плазмидной ДНК и нежелательных побочных реакций других компонентов клетки.
ЭДТА предотвращает деградацию ДНК
ЭДТА, или этилендиаминтетрауксусная кислота, захватывает или «хелатирует» ионы металлов из раствора, предотвращая их участие в нежелательных побочных реакциях. В буфер GTE добавляется 10 мМ ЭДТА. Его основная цель заключается в буфере для сбора свободного цинка, магния и кальция, тем самым предотвращая деградацию ДНК определенными путями, для которых требуются эти металлы.
Несколько важных советов
Держите буфер GTE холодным и делайте его в небольших количествах, чтобы предотвратить рост в нем нежелательных бактерий. Сахар и контролируемый pH - отличная среда для выращивания. Всегда используйте очищенную воду. В водопроводной воде может быть избыток ионов металлов из труб, что может подавить способность ЭДТА улавливать. Если вы подозреваете присутствие мешающей РНК в вашем образце, добавьте РНКазу A в концентрации 100 мкг на миллилитр в буфер GTE, чтобы устранить проблему.