Преимущества использования липких концевых ферментов

Молекулярное клонирование - это распространенный метод биотехнологии, с которым должен быть знаком каждый студент и исследователь. Молекулярное клонирование с использованием фермента, называемого рестриктазой, для разрезания ДНК человека на фрагменты, которые затем можно вставить в плазмидную ДНК бактериальной клетки. Ферменты рестрикции разрезают двухцепочечную ДНК пополам. В зависимости от рестрикционного фермента, разрез может иметь либо липкий, либо тупой конец. Липкие концы более полезны при молекулярном клонировании, поскольку они обеспечивают вставку фрагмента ДНК человека в плазмиду в правильном направлении. Процесс лигирования или слияния фрагментов ДНК требует меньше ДНК, если у ДНК липкие концы. Наконец, несколько ферментов рестрикции с липкими концами могут образовывать один и тот же липкий конец, даже если каждый фермент распознает разные рестрикционные последовательности. Это увеличивает вероятность того, что интересующий участок ДНК может быть вырезан липкими концевыми ферментами.

Рестрикционные ферменты - это ферменты, которые распознают определенные последовательности на двухцепочечной ДНК и разрезают ДНК пополам в этой последовательности. Распознаваемая последовательность называется сайтом рестрикции. Рестрикционные ферменты называются эндонуклеазами, потому что они разрезают двухцепочечную ДНК, как обычно существует ДНК, в местах, которые находятся между концами ДНК. Существует более 90 различных рестрикционных ферментов. Каждый распознает отдельный сайт рестрикции. Ферменты рестрикции расщепляют свои соответствующие сайты рестрикции в 5000 раз эффективнее, чем другие сайты, которые они не распознают.

Рестрикционные ферменты делятся на два основных класса. Они либо разрезают ДНК на липкие, либо на тупые концы. Липкий конец состоит из короткого участка нуклеотидов, строительных блоков ДНК, который не является парным. Этот непарный участок называется выступом. Говорят, что выступ является липким, потому что он хочет и будет соединяться с другим липким концом, который имеет дополнительную последовательность выступов. Липкие концы похожи на давно потерянных близнецов, стремящихся крепко обнять друг друга при встрече. С другой стороны, тупые концы не являются липкими, потому что все нуклеотиды уже спарены между двумя цепями ДНК. Преимущество липких концов заключается в том, что фрагмент ДНК человека может поместиться в бактериальную плазмиду только в одном направлении. Напротив, если и человеческая ДНК, и бактериальная плазмида имеют тупые концы, человеческая ДНК может быть вставлена ​​в плазмиду «голова к хвосту» или «хвост к голове».

Хотя ДНК с палочками на концах легче найти друг друга из-за их «липкости», ни липкие, ни тупые концы не могут слиться вместе в непрерывный кусок ДНК. Для образования непрерывной части ДНК, которая полностью связана, требуется фермент, называемый лигазой. Лигазы соединяют скелеты нуклеотидов липкими или тупыми концами, образуя непрерывную цепь нуклеотидов. Поскольку липкие концы находят друг друга быстрее из-за их притяжения друг к другу, процесс лигирования требует меньше ДНК человека и меньше плазмидной ДНК. Тупые концы ДНК и плазмиды с меньшей вероятностью найдут друг друга, поэтому для лигирования тупых концов требуется, чтобы в пробирку было помещено больше ДНК.

Сайты рестрикции расположены по всему геному организмов, но не равномерно. В плазмидах их можно сконструировать так, чтобы они располагались рядом друг с другом. Ученые, которые хотят вырезать фрагмент ДНК человека из генома человека, должны найти сайты рестрикции, которые находятся спереди и сзади области фрагмента. Помимо обеспечения вставки фрагмента ДНК в правильном направлении, различные ферменты липких концов могут создавать один и тот же липкий конец, даже если они распознают разные рестрикционные последовательности. Например, BamHI, BglII и Sau3A имеют разные последовательности распознавания, но производят один и тот же липкий конец GATC. Это увеличивает вероятность наличия сайтов ограничения липких концов, фланкирующих интересующий вас ген человека.