Как собирают образец ДНК и подготавливают его для исследования

Прежде чем они смогут секвенировать ДНК или изменить ее с помощью генной инженерии, ученые должны сначала выделить ее. Это может показаться сложной задачей, поскольку клетки содержат множество других соединений, таких как белки, жиры, сахара и небольшие молекулы. К счастью, биологи могут использовать химические свойства ДНК, чтобы отделить ДНК от этих загрязнителей и подготовить ее к дальнейшим исследованиям. Этот процесс называется экстракцией ДНК.

Есть много различных методов, используемых для выделения ДНК. Тот, который используется отдельной лабораторией, зависит от типа проводимого эксперимента и от того, насколько чистой должна быть ДНК. Ученые обычно начинают с образца, содержащего клетки - например, образца ткани или крови - и ломают клетки или лизируют их. Есть множество способов лизировать клетки. Добавление моющего средства приведет к их разложению и попаданию на них высокочастотных звуковых волн. В качестве альтернативы, смешивание образца со стеклянными шариками и его быстрое встряхивание физически разрушит клетки и высвободит их содержимое.

Если высокая чистота не требуется, ученые могут добавить фермент под названием протеиназа К для расщепления большей части белков в образце, а затем использовать его как есть. Однако этот метод очень грязный, так как большинство загрязняющих веществ все еще присутствует, поэтому он подходит только в том случае, если скорость является приоритетом, а чистота не является проблемой. Другой быстрый и грязный подход - удалить белки путем увеличения концентрации соли путем добавления солей, таких как ацетат аммония или калия, чтобы заставить белки осаждаться. Этот метод тоже довольно грязный, так как многие другие загрязнители все еще присутствуют.

Другой подход - лизировать клетки детергентом, а затем смешать раствор с изоамиловым спиртом, хлороформом и фенолом. Затем раствор разделяется на два слоя. Белки попадают в верхний органический слой, а ДНК остается в нижнем водном слое. Этот метод требует тщательного контроля концентрации соли и pH для хороших результатов. Это требует много времени, а фенол и хлороформ являются высокотоксичными химическими веществами. Следовательно, если когда-то экстракция фенол-хлороформом была рутинной процедурой, в последние годы стали более популярными другие методы.

Анионообменная хроматография обеспечивает более высокую чистоту и более стабильные результаты, чем экстракция фенол-хлороформ. Трубка или колонка заполнены мелкими частицами, на которых есть положительно заряженные участки, где может связываться отрицательно заряженная молекула или анион. ДНК связывается с этими анионообменными сайтами, в то время как другие загрязнители, такие как белки и РНК, смываются с колонки. Позже для снятия ДНК с колонки используется богатый солью раствор.

Самый быстрый и, пожалуй, самый надежный метод очистки ДНК - это использование специально изготовленного набора. Эти наборы содержат мембраны из силикагеля в тюбике. ДНК прилипает к мембране, в то время как другие загрязнения смываются с помощью серии специально приготовленных солевых растворов, которые идут в комплекте. Наконец, ДНК смывается с колонки раствором с низким содержанием соли. Эти наборы быстрые, простые в использовании и обеспечивают воспроизводимые результаты.

После выделения ДНК и ее ресуспендирования в буферном растворе с контролируемым pH последним шагом является проверка ее чистоты. Простой и удобный способ сделать это - проверить, сколько ультрафиолетового света он поглощает на длинах волн 260 и 280 нанометров. Поглощение при 260 нм, деленное на поглощение при 280 нм, должно равняться 1,8, если ДНК чистая. Измерение оптической плотности при 260 нанометрах также позволяет определить концентрацию ДНК.