Недостатки вестерн-блоттинга

Вестерн-блоттинг - одна из самых распространенных процедур в биохимических лабораториях. По сути, он отделяет белки от образца по размеру, а затем тестирует с использованием антител, чтобы определить, присутствует ли данный белок. Это полезно не только в исследованиях, но и в медицинских или диагностических лабораториях; Например, тесты на ВИЧ и болезнь Лайма включают иммуноферментный анализ (ИФА) с последующим вестерн-блоттингом, если ИФА дает положительный результат. Однако, несмотря на свою популярность, вестерн-блоттинг имеет ряд недостатков.

Классический вестерн-блоттинг не является количественным. Другими словами, хотя они могут сказать исследователям, присутствует ли конкретный белок, они не позволяют количественно определить, сколько белка присутствует. Некоторые биотехнологические компании сейчас продают наборы, которые позволяют исследователям или лаборантам определять количество белок присутствует с использованием стандартной кривой - но это работает, только если чистые образцы того же белка имеется в наличии. Более того, молекулярную массу белка можно оценить только с помощью вестерн-блоттинга, а не точно определить, как с помощью масс-спектрометрии.

Вестерн-блоттинг может быть выполнен только при наличии первичных антител против интересующего белка. Хотя антитела ко многим различным белкам доступны от биотехнологических компаний, они недешевы; Если первичные антитела недоступны для данного белка, будет невозможно выполнить вестерн-блоттинг для поиска этого конкретного белка. Более того, исследователи могут захотеть определить, был ли белок каким-либо образом модифицирован - фосфорилирован ли он (имел ли фосфатную группу), например, - а с методом вестерн-блоттинга им нужны антитела, специфичные к модифицированному белок.

Правильное выполнение Вестерн-блоттинга и получение хороших результатов может оказаться сложной задачей, поэтому персонал должен быть хорошо обучен. В этом, как и во многом другом, опыт, пожалуй, лучший наставник; Однако даже для опытного специалиста вестерн-блоттинг занимает много времени. Например, часть эксперимента с гель-электрофорезом обычно занимает от одного до двух часов. Конечно, во время работы геля можно выполнять и другие задачи, но для получения результатов эксперимента требуется некоторое время.

Антитела могут иногда демонстрировать некоторое связывание не с мишенью, что может ухудшить результаты. Более того, при вестерн-блоттинге вы используете антитело против определенного белка, поэтому результаты покажут вам только, присутствовал ли этот белок. Масс-спектрометрия высокого разрешения, напротив, выявляет все белки, присутствующие в образце, и в отличие от классического вестерн-блоттинга, она является количественной. Конечно, важно помнить, что масс-спектрометрия намного дороже и технически сложнее в использовании по сравнению с вестерн-блоттингом.