Бактерии выращивают в чашках Петри на твердой среде, известной как бактериальный агар, где образуются выпуклые круглые колонии. В отличие от отдельной бактериальной клетки, колония - это группа бактерий, достаточно большая, чтобы быть видимой невооруженным глазом. Рост бактерий можно измерить простым наблюдением за количеством присутствующих колоний; однако более количественные методы включают использование счетной камеры или, чаще, подсчет жизнеспособных планшетов. Последний используется наиболее часто, поскольку он также предоставляет качественную информацию, например, о влиянии различных условий роста. Поскольку в чашке Петри могут находиться миллиарды бактерий, для измерения сначала требуется разбавить образец, чтобы можно было подсчитать количество колоний.
В пробирке добавьте 10 мкл исходной бактериальной культуры к 90 мкл среды для разведения. Плотно закройте пробирку крышкой и осторожно встряхните, чтобы получить однородную смесь. Теперь образец составляет одну десятую от первоначальной концентрации.
Перенесите 10 микролитров этого нового образца в новую пробирку, содержащую 90 микролитров разбавляющей среды, снова перемешайте. И снова результатом будет дальнейшее разбавление образца - теперь оно будет составлять одну сотую от его первоначальной концентрации. Повторите это несколько раз, пока исходный образец не будет разбавлен между 104 и 1010 раз. Убедитесь, что на каждой пробирке указано правильное разведение, например 10.-1, 10-2 и так далее.
Вылейте 10 микролитров последнего завершенного разведения на чашку с агаром. Распределите бактериальный раствор распределяющим краем по всей поверхности чашки с агаром. Повторите это еще для двух пластин. Эти шаги также часто выполняются с другими уровнями разбавления для сравнения. Обязательно промаркируйте днище тарелок. Закройте каждую чашку крышками и дайте чашкам с агаром высохнуть в течение нескольких минут на лабораторном столе под пламенем или в инкубаторе. Поместите чашки в инкубатор, в котором должна быть установлена соответствующая температура для штамма бактерий. Оставьте расти на 12-16 часов.
Колонии должны быть видны через 16 часов; однако для некоторых генетических модификаций может потребоваться больше времени (например, развитие окраски). Когда колонии станут заметны, выньте чашки и найдите те, в которых содержится от 30 до 300 колоний. Используя перманентный маркер, поместите точку на дно чашки Петри - сторону с агаром, а не крышку - везде, где колония видна через агар. Подсчитайте каждую точку маркера. Повторите для каждого блюда.
Чтобы измерить количество бактерий в исходной культуре для этого эксперимента, разведение необходимо поменять местами в расчетах в двух местах. Во-первых, когда вы взяли один микролитр из пробирки и поместили в чашку Петри, вы взяли одну десятую разбавленного образца, поэтому вам нужно умножить все на 10, чтобы изменить это значение. Кроме того, если коэффициент разбавления в пробирке был, например, 10-7, то количество колоний нужно умножить на 107 чтобы обратить вспять эффект разбавления. Просто удалите знак минус из экспоненты в вычислениях. Используйте формулу:
[Количество подсчитанных колоний] × 10 × [сколько раз необходимо умножить образец, чтобы получить исходную концентрацию: например, 105] = Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на миллилитр исходной культуры. Это рост бактерий в ваших чашках Петри.