Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) - это биохимический метод определения белков в растворе. Как показано Мэтьюзом и др. В «Биохимии», образцы белка сначала загружают в «лунки» или отверстия на одном конце блока полиакриламидного геля. Затем к гелю прикладывают электрическое поле. SDS, добавленный к загруженным образцам, сводит на нет естественный заряд белков. По этой причине только молекулярная масса белка определяет скорость миграции белков по мере их движения через гель к положительно заряженному полюсу, отмечает Bitesize Bio. Следовательно, несколько белков в одном образце будут отделяться друг от друга и перемещаться в разные положения.
Сориентируйте гелевую фотографию. «Верх» - это расположение лунок, в которые изначально были добавлены пробы. «Снизу» - это место, где образцы мигрировали, и чаще всего он содержит фронт красителя, который указывает на мигрирующий фронт образцов. Либо слева, либо справа должен находиться «маркер», используемый в качестве предсказуемого ориентира молекулярной массы.
Промаркируйте образцы для каждой дорожки. Вверху образцы, добавленные в лунки, будут перемещаться вертикально в «дорожках». Таким образом, все полосы, видимые в вертикальном столбце, относятся к одному образцу, загруженному непосредственно над ним. Используйте линейку и ручку, чтобы навести границы на полосах движения, если колонки трудно визуализировать.
Отметьте молекулярные размеры полос на маркерной дорожке. Имеющиеся в продаже маркеры поставляются с изображением ожидаемого рисунка полос и молекулярных масс каждой полосы. Полосы - это темные горизонтальные «полоски», которые на самом деле представляют собой окрашенный белок, внедренный в гель.
Нарисуйте светлые горизонтальные линии, идущие от каждой полосы маркера к противоположному краю геля. Будьте осторожны, чтобы эти линии были параллельны лункам и лицевой стороне красителя. Эти линии указывают, где на каждой дорожке будут расположены белки с молекулярной массой, указанной каждой из полос маркеров. Например, полоса в полосе 4, которая находится чуть ниже линии, продолжающейся от 25 килодальтон. Полоса маркера предполагает, что полоса дорожки 4 составляет почти, но не совсем 25 килодальтон в молекулярном масса.
Обозначьте каждую полосу на каждой дорожке ее предполагаемой молекулярной массой. Используйте маркеры в качестве ориентира и оцените значения между размерами маркеров.
Под фотографией геля составьте список «белков» для каждой дорожки. Для начала укажите, что известно о каждом образце, например о его происхождении или условиях. Затем перечислите предполагаемую молекулярную массу каждой полосы на дорожке. Дорожки с одной полосой указывают на то, что образец содержит только один белок. Дорожки с множеством полос указывают на присутствие множества белков. Полосы, которые идут с фронтом миграции, меньше, чем предполагает ближайший маркер, и, вероятно, не могут быть предсказаны, кроме как «меньше, чем» указывает маркер.
В списке белков обратите внимание на странности. «Размытый» вид может указывать на присутствие слишком большого количества белков или на то, что вязкость образца влияет на его миграцию. Если полосы кажутся выходящими за пределы край полосы или довольно большие по сравнению с другими полосами, то концентрация этого белка, вероятно, слишком высока и ее следует разбавить в будущем электрофорез. Сероватый оттенок по всей полосе, более темный, чем цвет фона геля, указывает на неразличимые фрагменты белка.
Определите идентичность белков на каждой дорожке. Хотя это делается с использованием только молекулярной массы, источник каждой дорожки, вероятно, также будет указывать на подсказки. Учтите, что при некоторых условиях белки могут поддерживать ассоциацию димеров или тримеров в геле. Следовательно, один белок может отображаться на геле в виде трех отдельных полос. Даже если белки не могут быть идентифицированы, относительная темнота полос может означать концентрации белков в растворе. Любые любопытные и неизвестные белки можно выделить прямо из исходного геля и отправить на идентификацию.
Вещи, которые вам понадобятся
- Фотография геля SDS-PAGE, окрашенного
- Ключ для используемого маркера молекулярной массы
- Правитель
- Ручка