Care este primul pas într-o reacție în lanț a polimerazei?

Reacția în lanț a polimerazei, sau PCR, este o tehnică care fotocopieză un fragment de ADN în mai multe fragmente - exponențial multe. Primul pas este în PCR este încălzirea ADN-ului astfel încât să se denatureze sau să se topească în fire simple. Structura ADN-ului este ca o scară de frânghie în care treptele sunt frânghii cu capete magnetice. Magneții se conectează pentru a forma treptele, numite perechi de baze, și astfel rezistă să fie despărțiți. Fiecare fragment de ADN se topește în fire individuale la temperaturi diferite. Înțelegerea modului în care structura ADN este menținută împreună de părțile individuale ale ADN-ului va oferi o perspectivă asupra motivului diferite fragmente de ADN se topesc la temperaturi diferite și de ce sunt necesare astfel de temperaturi ridicate în prima loc.

Primul pas al PCR este de a topi ADN-ul astfel încât ADN-ul bicatenar să se separe în ADN monocatenar. Pentru ADN-ul mamiferelor, acest prim pas implică, de obicei, căldură de aproximativ 95 grade Celsius (aproximativ 200 Fahrenheit). La această temperatură, legăturile de hidrogen dintre perechile de baze A-T și G-C, sau treptele din scara ADN, se separă, dezarhivând ADN-ul cu catenă dublă. Cu toate acestea, temperatura nu este suficient de fierbinte pentru a sparge coloana vertebrală fosfat-zahăr care formează firele unice sau polii scării. Separarea completă a catenelor unice le pregătește pentru a doua etapă a PCR, care se răcește pentru a permite fragmentelor scurte de ADN, numite primeri, să se lege cu catenele simple.

Unul dintre motivele pentru care ADN-ul este încălzit la temperatura ridicată de 95 de grade Celcius este acela că, cu cât este mai lungă catena dublă de ADN, cu atât mai mult vrea să rămână împreună. Lungimea ADN este un factor care afectează punctul de topire ales pentru PCR pe acea bucată de ADN. Bazele A-T și G-C se împerechează în legătura ADN cu catenă dublă între ele pentru a menține împreună structura cu catenă dublă. Cu cât s-au legat mai multe perechi de baze consecutive între două fire simple, cu atât mai mult vor vecinii lor să se lege și cu atât atracția dintre cele două fire devine mai puternică. Este ca un fermoar din magneți mici. Pe măsură ce închideți fermoarul, magneții vor dori în mod natural să se închidă cu fermoar și să rămână fermoar.

Un alt factor care afectează temperatura de topire de ales pentru fragmentul de interes ADN este cantitatea de perechi de baze G-C prezente în acel fragment. Fiecare pereche de baze este ca doi mini-magneți care atrag. O pereche formată din G și C este mult mai puternic atrasă decât o pereche A și T. Astfel, o bucată de ADN care are mai multe perechi G-C decât un alt fragment va necesita o temperatură mai ridicată înainte de a se topi în fire simple. ADN-ul absoarbe în mod natural lumina ultravioletă - la lungimea de undă de 260 nanometri, pentru a fi exact - și ADN-ul monocatenar absoarbe mai multă lumină decât ADN-ul dublu catenar. Deci, măsurarea cantității de lumină absorbită este o modalitate de a măsura cât de mult ADN-ul tău dublu catenar s-a topit în fire simple. Efectul „fermoar magnetic” al perechilor de baze G-C și A-T este ceea ce determină un grafic al absorbanței luminii ADN-ul cu catenă dublă a reprezentat o creștere a temperaturii pentru a fi sigmoidal, în formă de S și nu a linie dreapta. Curba S reprezintă rezistența la lucru în echipă pe care perechile de baze o exercită împotriva căldurii deoarece nu vor să se separe.

Temperatura la care o lungime de ADN se topește în fire simple se numește temperatura ei de topire, care este notată prin abrevierea „Tm”. Aceasta indică temperatura la care jumătate din ADN-ul dintr-o soluție s-a topit în fire simple și cealaltă jumătate este încă în fire dublu formă. Temperatura de topire este diferită pentru fiecare fragment de ADN. ADN-ul mamiferelor are un conținut de G-C de 40%, ceea ce înseamnă că restul de 60% din perechile de baze sunt As și Ts. Conținutul său de 40% G-C face ca ADN-ul mamiferelor să se topească la 87 grade Celcius (aproximativ 189 Fahrenheit). Acesta este motivul pentru care primul pas al PCR pe ADN-ul mamiferelor este încălzirea acestuia la 94 de grade Celcius (201 Fahrenheit). Cu doar șapte grade mai fierbinte decât temperatura de topire și toate firele duble se vor topi complet în fire simple.