Dezavantajele electroforezei pe gel

Electroforeza pe gel este o tehnică în care moleculele biologice sunt separate unele de altele și identificate în cercetarea biologică sau în diagnosticul medical. De la dezvoltarea lor în anii 1970, aceste tehnici au fost de neprețuit în identificarea genelor (ADN) și a produselor genetice (ARN și proteine) de interes pentru cercetare. În ultimii ani, au apărut tehnici mai noi care oferă o mai mare specificitate și detalii despre ceea ce se întâmplă în sistemele vii. Deși acestea nu au înlocuit tehnicile de electroforeză, iar manipulările avansate pot extinde viabilitatea tehnicii, este important să ne dăm seama ce poate și ce nu poate face electroforeza pe gel.

Electroforeza este specifică oricărui țesut pe care l-ați prelevat. De exemplu, dacă efectuați un Southern blot (un tip de electroforeză) pe un tampon obraz, vă uitați la gene din celulele epiteliale ale obrazului și nicăieri altundeva în corpul dumneavoastră. Uneori, acest lucru poate fi benefic, dar cercetătorii sunt frecvent interesați de efecte mai răspândite.

Tehnici precum hibridizarea in situ (ISH) pot lua o secțiune de țesut și analiza expresia genelor la fiecare zonă mică a probei respective. Astfel, cercetătorii pot privi fiecare zonă cerebrală dintr-un eșantion cu ISH, în timp ce tehnicile de electroforeză pot privi doar câteva zone la un moment dat.

Electroforeza pe gel poate separa în mod eficient proteine ​​similare cu greutăți diferite (aceasta este o tehnică numită Western blot). Le poate separa mai precis printr-o tehnică cunoscută sub numele de electroforeză 2d; acest lucru este frecvent în proteomică.

Din păcate, toate măsurătorile efectuate din această tehnică sunt semicantitative în cel mai bun caz. Pentru a obține masa (greutatea) precisă a proteinelor, spectroscopia de masă trebuie utilizată după ce proteina a fost purificată prin electroforeză. Mai mult, compararea cantităților relative de molecule diferite se bazează pe densitatea benzii (întuneric) a diferitelor pete de pe gel. Această metodă are un anumit grad de eroare, iar eșantioanele sunt de obicei rulate de mai multe ori pentru a obține rezultate curate.

Electroforeza este o tehnică de izolare și identificare vizuală a diferitelor biomolecule. Acest lucru se face prin trecerea unui curent electric prin gel pentru a separa moleculele încărcate de diferite greutăți. Dacă molecula care te interesează nu este suficient de comună, banda ei va fi practic invizibilă și dificil de măsurat.

ADN-ul și ARN-ul pot fi amplificate oarecum înainte de a rula electroforeza, dar nu este practic să faceți acest lucru cu proteinele. Prin urmare, este necesară o probă mare de țesut pentru a efectua aceste teste. Acest lucru poate limita utilitatea tehnicii, în special în analiza medicală. Este practic imposibil să rulați electroforeza pe probe dintr-o singură celulă; citometria în flux și imunohistochimia sunt mai frecvent utilizate pentru a evalua expresia celulă cu celulă a proteinelor. O tehnică numită PCR este excelentă pentru măsurarea precisă a unor cantități mici de ARN.

Electroforeza este excelentă pentru separarea și identificarea biomoleculelor de dimensiuni medii și mari. Cu toate acestea, multe dintre moleculele pe care cercetătorii doresc să le privească sunt mai mici; hormonii mici, neurotransmițători și ioni nu pot fi măsurați prin electroforeză. Acest lucru este din două motive: nu reacționează corect cu preparatul pentru electroforeză (de obicei o tehnică numite SDS PAGE) și, chiar dacă ar face-o, sunt prea mici pentru a se separa în mod corespunzător și s-ar repezi pe fundul gelul. Aceste molecule sunt în schimb măsurate prin tehnici precum RIAAs (imunotesturi radio) și ELISA (test imunosorbant legat de enzime).

Electroforeza pe gel este, în general, debit redus, ceea ce înseamnă că nu produce date în mod rapid. Contrastează electroforeza, unde poți privi o mică mână de molecule de ARN la un moment dat, cu PCR (reacție în lanț a polimerazei), care poate evalua simultan mii de probe. În mod similar, citometria în flux poate lua măsurători de la mii de celule individuale și poate deveni complexă corelații, în timp ce electroforeza privește celulele în masă și nu poate face atât de bine discriminări. PCR și citometria de flux reprezintă procese masiv paralele și respectiv seriale și ambele depășesc cu mult abilitățile electroforezei de a genera date de cercetare.