ADN
Acidul dezoxiribonucleic și proteinele. ADN-ul este organizat în unități numite gene, fiecare dintre acestea codificând un anumit ARN sau secvență proteică. Genele sunt studiate pentru a afla despre structura și funcția biologică, evoluția, boala și multe alte aspecte ale sistemelor vii. Pentru a studia în detaliu genele, ADN-ul trebuie izolat și purificat de celulele de interes.
Extragerea ADN-ului
Deși ADN-ul dintr-o singură celulă poate fi extras și studiat, nu este suficient să vezi cu ochiul liber. Pentru a obține o cantitate suficientă pentru spooling, cu atât mai multe celule trebuie să lucrezi cu atât mai bine (multe milioane).
Protocoalele exacte variază considerabil pentru a ține seama de caracteristicile unice ale eșantioanelor specifice, dar pașii generali sunt omogenizarea, liza, digestia, separarea și colectarea. Procedura se efectuează cel mai bine într-un tub de sticlă sau plastic mic (în funcție de mărimea probei).
O probă este în general amestecată sau împământată pentru a separa complet celulele una de cealaltă. Acest lucru face ca ingredientele celulare să fie mai accesibile pentru reactivii care urmează. Detergentul sau enzimele sunt apoi adăugate la omogenizat pentru a liza membranele celulare (și membranele nucleare dacă celulele sunt eucariote) pentru a elibera ADN-ul. În acest moment, ADN-ul este înconjurat de proteine, lipide, carbohidrați, orice altceva conținut în celule.
O digestie enzimatică suplimentară poate fi necesară pentru descompunerea proteinelor, astfel încât acestea să nu se lege de ADN și să interfereze cu colectarea acestuia. ADN-ul este separat de restul conținutului celular prin adăugarea de alcool rece, pur, etilic sau izopropilic. ADN-ul nu este solubil în acești alcooli, așa că se va condensa pentru a încerca să minimizeze contactul cu alcoolul. ADN-ul condensat este apoi colectat, de obicei prin centrifugare sau bobinare.
Spooling ADN
Colectarea ADN prin spool este eficientă atunci când se obține o cantitate mare de ADN dintr-o procedură de extracție. Este, de asemenea, o metodă de demonstrație excelentă, deoarece o încurcătură impresionantă de ADN pur este clar vizibilă.
Pentru spularea ADN-ului, etapa de separare trebuie efectuată cu atenție. Dacă nu a făcut parte din amestecul de reactivi de liză adăugat anterior, o soluție concentrată de sare (clorură de sodiu) trebuie adăugată la soluție înainte de etapa de adăugare a alcoolului. Alcoolul rece este turnat încet pe partea eprubetei pentru a forma un strat deasupra soluției apoase, evitând amestecul. Dacă se face corect, alcoolul își va forma propriul strat deasupra stratului sărat. Apoi vine spoolul.
Pentru a colecta ADN-ul din stratul sărat, așezați cu grijă o tijă de amestec din sticlă prin stratul de alcool până când atinge fundul tubului. Rotiți încet tija între degete, în timp ce urmăriți interfața dintre cele două straturi. Dacă este suficient ADN, acesta se va aglomera la interfața dintre straturi pentru a forma o masă translucidă lăptoasă. Învârtiți tija pentru a înfășura ADN-ul în jurul ei (adică partea de bobinare) și trageți-l din tub. ADN-ul poate fi transferat într-un alt tub de alcool pur pentru depozitare sau analiză ulterioară.