Electroforeză cu gel este o tehnică de laborator utilizată în mod obișnuit, cu multe aplicații practice, inclusiv amprentarea ADN-ului și secvențierea genomului. Procesul presupune separarea ADN fragmentează folosind un curent electric în timp ce urmărește rata de mișcare moleculară printr-un gel de filtrare.
Adăugarea colorantului de urmărire albastru sau portocaliu la probele de ADN incolore vă permite să vedeți proba dvs. și să obțineți informații despre cum se mișcă moleculele de ADN în timpul electroforezei. Identificarea se bazează pe dimensiunea benzilor de ADN de pe gel după migrarea moleculelor.
Cum funcționează electroforeza pe gel
Electroforeză cu gel trage fragmente de ADN printr-un gel folosind un curent electric pentru a izola și identifica moleculele de ADN după mărime și sarcină electrică. Gelul este adesea realizat cu pulbere de agaroză - o polizaharidă extrasă din alge.
Agaroză este adăugată la o soluție tampon de apă și sare și amestecul este încălzit și răcit pentru a face un gel poros care va acționa ca o matrice de filtrare în timpul procedurii de electroforeză. Gelul este apoi plasat într-o unitate de electroforeză și acoperit cu soluție tampon care conduce
Soluțiile care conțin ADN și coloranți de încărcare sunt pipetate în puțuri mici din gel care trebuie făcute în timpul preparării gelului. Vopselete ajutvezi clar proba pe care îl adăugați la puțurile de gel situate lângă electrodul negativ al unității de electroforeză.
Un electrod pozitiv este situat la capătul opus. Un standard cunoscut de fragmente de ADN este plasat în primul puț care va crea o scară de benzi de ADN în scopuri de comparație și identificare.
Coloana vertebrală a fosfatului moleculelor de ADN conferă ADN-ului o sarcină negativă. Opusele atrag astfel încât, în consecință, moleculele de ADN sunt atrase de electrodul pozitiv și încep să se miște sau „migrează”, atunci când este pornit un curent electric.
Fragmentele de ADN de dimensiuni mai mici călătoresc mai repede decât fragmentele mai mari, deoarece întâmpină o rezistență mai mică pe măsură ce migrează prin matricea poroasă a gelului. Fragmente de ADN de dimensiuni similare formează benzi de ADN în gel.
Încărcarea Dye Scopul și importanța
ADN-ul este incolor, deci adăugarea urmărirea coloranților la un eșantion te ajută determina rata de miscare de molecule de proteine de dimensiuni diferite în gel în timpul electroforezei. Exemple de coloranți de încărcare care se deplasează odată cu proba de ADN includ bromofenolalbastru și xilen cianol.
Colorantul ales nu trebuie să fie reactiv sau să modifice ADN-ul. Albastrul de bromofenol este un colorant folosit pentru a urmări șuvițe de ADN de dimensiuni mai mici care conțin aproximativ 400 de perechi de baze, în timp ce xilen cianolul este mai bun pentru șuvițele de ADN mai mari cu până la 8.000 de perechi de baze. Colorantul ales nu trebuie să fie reactiv sau să modifice ADN-ul.
Rolul glicerinei în electroforeza în gel de agaroză
Când vă pregătiți proba ADN pentru electroforeză, va trebui să adăugați glicerol și apă împreună cu coloranți de încărcare. Glicerolul este o substanță grea, siropoasă, care conferă mai multă densitate probei de ADN înainte de a fi introdusă în godeuri la un capăt al foii de gel.
Fără glicerol, proba de ADN s-ar dispersa în loc să se scufunde și să formeze un strat în fântână așa cum ar trebui să facă pentru a forma o scară de ADN.
Urmărirea colorantului în PAGINA SDS
Electroforeza pe gel de poliacrilamidă cu dodecil sulfat de sodiu (SDS PAGE) este o tehnică adecvată pentru separarea proteinelor și aminoacizilor, care sunt mai mici și mai complexe decât moleculele ADN liniare. Pentru electroforeză se folosește poliacrilamidă (gel SDS PAGE) în locul gelului de agaroză.
Albastrul de bromofenol (BPB) este adăugat la tamponul de probă ca a colorant de urmărire care se deplasează în aceeași direcție de separare a proteinelor și delimitează marginea lor anterioară.
Rolul colorantului care leagă ADN-ul
Colorant care leagă ADN-ul, cum ar fi de culoare portocalie bromura de etidiu poate fi adăugată la gel sau la tamponul de electroforeză. După cum sugerează și numele, colorantul se atașează la molecula de ADN.
Trebuie acordată o mare atenție la manipularea acestui colorant mutagen, deoarece se poate lega de ADN-ul din celulele pielii. Spre deosebire de coloranții de urmărire, bromura de etidiu fluoresc strălucitor sub lumina UV, făcând vizibile benzile ADN.
