În biologia moleculară, poate fi o alegere bună a tamponului și pregătirea pentru diferite etape de izolare a ADN-ului diferența dintre trecerea la expresia proteinei sau deschiderea unui alt kit maxi-preparat pentru a începe peste. În ciuda importanței lor cruciale, rețetele tampon sunt adesea doar acelea - rețete scrise fără explicații sau rațiuni pentru diferitele componente. Un astfel de tampon este glucoza-tris-EDTA sau tampon GTE.
Pentru ce se folosește GTE?
GTE este utilizat pentru resuspendarea peletelor de celule bacteriene înainte de lizarea (spargerea) celulelor și recoltarea ADN-ului plasmidic în interior. Lizozimul, care înmoaie membranele celulare, este adesea adăugat împreună cu tamponul GTE. Obținerea unei suspensii omogene de celule întregi în timpul acestei etape, astfel încât soluția de liză adăugată ulterior să poată ajunge la toate celulele, este esențială pentru obținerea unor randamente bune de ADN. GTE este conceput pentru a face acest lucru, oferind în același timp un mediu stabil pentru ADN.
Glucoza pentru osmolaritate
50mM (milimolar) glucoză de zahăr este adăugată la tamponul GTE pentru a menține osmolaritatea în cazul în care concentrația de solut în afara celulelor este apropiată de cea din interiorul celulelor. Acest lucru previne liza celulară prematură, care poate provoca randamente mai mici de ADN datorită agregării și degradării. Celelalte componente ale tamponului contribuie, de asemenea, la osmolaritatea soluției, dar glucoza, a fi un non-electrolit, este o alegere bună, deoarece nu interferează cu tamponul soluției proprietăți.
Tris pentru stabilitatea pH-ului
Tris este numele scurt pentru tris (hidroximetil) aminometan, care este un tampon de pH foarte comun. În cazul tamponului GTE, sarea acidă (Tris-HCI) este adăugată la tampon la o concentrație de 25mM. Aceasta menține pH-ul soluției la un 8,0 aproape fiziologic, un pH ideal pentru prevenirea hidrolizei acide (degradării) ADN-ului plasmidic și a reacțiilor secundare nedorite ale celorlalte componente ale celulei.
EDTA previne degradarea ADN-ului
EDTA sau acidul etilendiaminetetraacetic captează sau „chelează” ionii metalici din soluție, împiedicându-i să participe la reacții secundare nedorite. În tamponul GTE, EDTA este adăugat la 10mM. Scopul său principal este în tampon de a rotunji zinc, magneziu și calciu liber, prevenind astfel degradarea ADN-ului prin anumite căi care necesită aceste metale.
Câteva sfaturi importante
Păstrați tamponul GTE rece și faceți-l în cantități mici pentru a preveni dezvoltarea bacteriilor neintenționate în acesta. Zahărul și pH-ul controlat asigură un mediu de creștere excelent. Folosiți întotdeauna apă purificată. Apa de la robinet poate avea un exces de ioni metalici din țevi, ceea ce poate copleși capacitatea EDTA de a captura. Dacă bănuiți prezența ARN-ului interferent în proba dvs., adăugați RNase A la 100 micrograme pe mililitru în tamponul GTE pentru a elimina problema.
