Cum se colectează și se pregătește pentru studiu un eșantion de ADN

Înainte să poată secvența ADN-ul sau să-l modifice prin inginerie genetică, oamenii de știință trebuie mai întâi să îl izoleze. Aceasta ar putea părea o sarcină dificilă, deoarece celulele conțin o mare varietate de alți compuși, cum ar fi proteine, grăsimi, zaharuri și molecule mici. Din fericire, biologii pot folosi proprietățile chimice ale ADN-ului pentru a separa ADN-ul de acești contaminanți și pentru a-l pregăti pentru studii ulterioare. Acest proces se numește extracția ADN-ului.

Există multe tehnici diferite utilizate pentru extracția ADN-ului. Cel folosit de un laborator individual depinde de tipul de experiment care trebuie efectuat și de cât de pur trebuie să fie ADN-ul. Oamenii de știință încep, în general, cu un eșantion care conține celule - o probă de țesut sau de sânge, de exemplu - și rup celulele deschise sau le lizează. Există o varietate de moduri în care puteți liza celulele. Adăugarea unui detergent îi va face să se destrame, la fel ca și supunerea lor la undele sonore de înaltă frecvență. Alternativ, amestecarea probei cu margele de sticlă și vibrarea rapidă a acesteia vor rupe fizic celulele și le vor elibera conținutul.

Dacă nu este necesară o puritate ridicată, oamenii de știință pot adăuga o enzimă numită proteinază K pentru a descompune majoritatea proteinelor din probă, apoi să o folosească așa cum este. Cu toate acestea, această tehnică este foarte murdară, deoarece majoritatea contaminanților sunt încă prezenți, deci este potrivită numai dacă viteza este o prioritate și puritatea nu este o problemă. O altă abordare rapidă și murdară este eliminarea proteinelor prin creșterea concentrației de sare prin adăugarea de săruri precum amoniul sau acetat de potasiu pentru a forța proteinele să precipite. Și această tehnică este destul de murdară, deoarece mulți alți contaminanți sunt încă prezenți.

O altă abordare este lizarea celulelor cu detergent, apoi amestecarea soluției cu alcool izoamilic, cloroform și fenol. Soluția se separă apoi în două straturi. Proteinele ajung în stratul organic superior, în timp ce ADN-ul rămâne în stratul apos inferior. Această tehnică necesită un control atent al concentrației de sare și pH pentru rezultate bune. Este consumator de timp și atât fenolul, cât și cloroformul sunt substanțe chimice foarte toxice. În consecință, în timp ce extracțiile de fenol-cloroform au fost odată de rutină, alte tehnici au devenit mai populare în ultimii ani.

Cromatografia cu schimb de anioni oferă o puritate mai mare și rezultate mai consistente decât extracția cu fenol-cloroform. Un tub sau o coloană este împachetat cu particule mici care au site-uri încărcate pozitiv pe ele unde se pot lega o moleculă sau un anion încărcat negativ. ADN-ul se leagă de aceste locuri de schimb de anioni, în timp ce alți contaminanți precum proteinele și ARN-ul sunt spălați de pe coloană. Mai târziu, o soluție bogată în sare este utilizată pentru a extrage ADN-ul de pe coloană.

Cea mai rapidă și poate cea mai fiabilă tehnică pentru purificarea ADN-ului este utilizarea unui kit special fabricat. Aceste truse conțin membrane de silicagel într-un tub. ADN-ul se lipeste de membrană în timp ce alți contaminanți sunt spălați folosind o serie de soluții de sare special pregătite care vin împreună cu kitul. În cele din urmă, ADN-ul este spălat de pe coloană cu o soluție cu conținut scăzut de sare. Aceste truse sunt rapide, ușor de utilizat și oferă rezultate reproductibile.

Odată ce ADN-ul a fost izolat și resuspendat într-o soluție tampon controlată de pH, ultimul pas este testarea purității acestuia. O modalitate ușoară și convenabilă de a face acest lucru este verificarea cantității de lumină ultravioletă pe care o absoarbe la lungimile de undă de 260 și 280 nanometri. Absorbția la 260 nanometri împărțită la absorbția la 280 nanometri ar trebui să fie egală cu 1,8 dacă ADN-ul este pur. Măsurarea absorbanței la 260 nanometri vă permite, de asemenea, să determinați concentrația ADN-ului.