Spectrofotometria este un instrument de neprețuit în chimie și biologie. Ideea de bază este simplă: diferite substanțe absorb lumina / radiația electromagnetică mai bine la unele lungimi de undă decât la altele. De aceea, unele materiale sunt transparente, în timp ce altele sunt colorate, de exemplu. Când străluciți o anumită lungime de undă printr-o soluție, cu cât este mai mare concentrația acesteia, cu atât va absorbi mai multă lumină. Pentru a calcula concentrația, trebuie să comparați citirea cu citirile pentru standardele de concentrație cunoscută. Procedura de mai jos este o procedură destul de generică scrisă cu un laborator de predare chimie în minte, dar poate fi modificată și pentru alte setări.
Ca întotdeauna când lucrați într-un laborator, îmbrăcați-vă ochelarii, mănușile și haina cu mâneci lungi pentru a vă asigura propria siguranță.
Strângeți becul de cauciuc pentru a-l goli de aer, apoi așezați-l deasupra pipetei dvs. gradate și lăsați becul să se relaxeze, astfel încât să aspire apa în pipetă. Apoi, scoateți becul și acoperiți partea superioară a pipetei cu degetul; aceasta va sigila pipeta, astfel încât soluția din interior să nu curgă afară până când nu este îndepărtat degetul. Ridicați ușor marginea degetului pentru a lăsa puțină soluție să curgă din pipetă, până când ajungeți la volumul dorit. Exersați cu puțină apă și un pahar pentru a vă da seama de modul în care funcționează pipeta gradată. Link-ul din secțiunea Resurse are un videoclip pentru a vă arăta cum să utilizați o pipetă în cazul în care nu ați mai lucrat niciodată cu una.
Etichetați 5 eprubete ca standarde 1-5. Le puteți eticheta folosind bandă de mascare și un stilou sau folosind un marker de ștergere uscată.
Alegeți cinci concentrații pentru standardele dvs. Doriți ca concentrațiile standard să fie separate între ele cu aproximativ același interval - de exemplu, 0,1 molare, 0,2 molare, 0,3 molare etc. - și în aproximativ aceeași gamă cu ceea ce vă așteptați să fie necunoscutul dvs. Pentru moment, utilizați următoarele cinci concentrații, dar nu uitați că va trebui să le modificați atunci când efectuați propriul experiment:
Standard 1: 0.1 molar Standard 2: 0.2 molar Standard 3: 0.3 molar Standard 4: 0.4 molar Standard 5: 0.5 molar
Apoi, luați soluția etalon 1 molar și adăugați următoarele cantități la eprubetele 1-5. Amintiți-vă, aceste cantități sunt calculate utilizând concentrațiile enumerate mai sus, deci este posibil să fie necesar să le modificați după cum este necesar atunci când efectuați propriul experiment.
Standard 1: 0,8 mililitri Standard 2: 1,6 mililitri Standard 3: 2,4 mililitri Standard 4: 3,2 mililitri Standard 5: 4 mililitri
Clătiți pipeta gradată, apoi transferați următoarele cantități de apă deionizată:
Standard 1: 7,2 mililitri Standard 2: 6,4 mililitri Standard 3: 5,6 mililitri Standard 4: 4,8 mililitri Standard 5: 4,0 mililitri
Practic, ideea este de a aduce cantitatea de soluție din fiecare tub până la 8 mililitri.
Capaceți fiecare dintre tuburile standard cu parafilm și inversați-le pentru a le amesteca.
Marcați alte cinci eprubete ca „Necunoscut 1-5”. Adăugați aceleași cantități de soluție necunoscută sau de testare la fiecare pe care le-ați utilizat cu soluția 1 molar pentru standarde. Cu alte cuvinte, necunoscutul 1 va conține 0,8 mililitri de soluție de test și 7,2 mililitri de apă, necunoscută 2 va conține 1,6 mililitri de soluție de testat și 6,4 mililitri de apă și așa mai departe.
Capaceți fiecare dintre necunoscute cu parafilm și inversați cu atenție pentru a amesteca.
Porniți spectrofotometrul și lăsați-l să se încălzească. Durata necesară va depinde de model și de producător.
Setați lungimea de undă pe spectrofotometru. Lungimea de undă va depinde de tipul de substanță chimică din experimentul dvs. Pentru moment, presupuneți 500 nm, deși amintiți-vă că va trebui să schimbați acest lucru pentru diferite experimente.
Calibrați-vă spectrofotometrul. Procedura de calibrare va varia în funcție de dispozitivul pe care îl utilizați. Pentru Spectronic 20, un model obișnuit în laboratoarele de predare, veți regla mai întâi mașina astfel încât să citească „0 la sută T” când nu este încărcată o cuvetă, reglați-o astfel încât să citească „100% T” atunci când o cuvă goală care conține doar apă deionizată este încărcat. Aceste proceduri pot varia în funcție de tipul de mașină pe care o utilizați, deci consultați instrucțiunile producătorului pentru detalii.
După ce mașina este calibrată, luați eprubeta standard 1 și turnați conținutul într-o cuvă curată până când ajung la linia de umplere. Ștergeți cuveta cu un kimwipe pentru a elimina amprentele digitale sau alte murdării. Introduceți cuveta în spectrofotometru și înregistrați "% T" citire.
Repetați această procedură pentru toate cele 10 probe. FIȚI CERTA pentru a curăța cuva între probe pentru a vă asigura că rezultatele dvs. sunt cât mai exacte.
Luați rezultatele pentru standardele dvs. și introduceți-le într-o foaie de calcul / program grafic, cum ar fi Excel sau OpenOffice.
Folosind programul de foaie de calcul, împărțiți 100% la fiecare dintre valorile „% T” pentru standarde, apoi luați jurnalul rezultatului. Acest calcul vă va oferi absorbanță. Dacă introduceți formula, programul dvs. de foaie de calcul va face calculul pentru dvs.
Exemplu: Dacă% T este 50,6, formula introdusă în programul de foaie de calcul ar fi următoarea:
jurnal (100 / 50,6)
Programul de foaie de calcul va face aritmetica.
Faceți același lucru pentru toate cele cinci valori necunoscute / experimentale.
Graficați valorile absorbantei pentru toate cele cinci standarde, cu concentrație pe axa x și absorbanță pe axa y. Folosind programul de foaie de calcul, încadrați o ecuație liniară în acest grafic. Ecuația va avea forma y = mx + b. Majoritatea programelor de foi de calcul vor avea o funcție de regresie liniară. Consultați manualul utilizatorului pentru programul dvs. de foaie de calcul pentru detalii despre modul de utilizare a funcției de regresie liniară.
Luați ecuația pentru cea mai potrivită linie din programul dvs. de calcul tabelar și rezolvați-o pentru y scăzând b din ambele părți și împărțind ambele părți la m. Rezultatul va arăta după cum urmează:
(y - b) / m = x
unde b și m sunt valori găsite de programul dvs. de calcul tabelar.
Verificați valorile de absorbanță pentru necunoscute și alegeți trei care se încadrează aproximativ în același interval cu standardele. Utilizați aceste trei valori de absorbanță pentru calculele rămase. Dacă toate cele cinci se încadrează în aceeași gamă ca și standardele, le puteți folosi pe toate în schimb, dar trebuie să utilizați cel puțin trei.
Conectați fiecare dintre cele trei valori de absorbanță în ecuația dvs. în locul lui y. Amintiți-vă că ecuația dvs. avea următoarea formă:
(y - b) / m = x
Deci, veți dori să conectați valoarea de absorbanță pentru fiecare necunoscut în ecuația în locul lui y, apoi să calculați x. Puteți utiliza programul de foi de calcul pentru a face acest calcul pentru dvs. și a-l face mai rapid. Ați calculat acum concentrația substanței chimice de interes în trei dintre necunoscutele dvs. diluate. Soluția originală a fost diluată pentru a pregăti aceste necunoscute, totuși, așa că acum trebuie să lucrați înapoi și să calculați concentrația soluției originale pe baza factorului de diluare.
Fiecare probă necunoscută introdusă în spectrofotometru a fost diluată cu o cantitate diferită. În consecință, ar trebui să împărțiți acum concentrația calculată pe baza absorbanței pentru fiecare citire necunoscută la următoarele:
Necunoscut 1: Împarte la 0,1 Necunoscut 2: Împarte la 0,2 Necunoscut 3: Împarte la 0,3 Necunoscut 4: Împarte la 0,4 Necunoscut 5: Împarte la 0,5
Amintiți-vă, totuși, că aceste cifre se bazează pe presupunerea că utilizați diluțiile prezentate mai sus. Nu uitați să modificați aceste valori dacă ați diluat probele cu o cantitate diferită.
Adăugați rezultatele împreună și împărțiți-le la numărul de rezultate. Acest lucru vă va oferi o medie. Raportați acest număr ca constatarea concentrației soluției originale.
Lucruri de care ai nevoie
- Creion
- Hârtie
- Calculator
- Mănuși
- Ochelari de protecţie
- Palton cu mâneci lungi
- Spectrofotometru
- Cuve de sticlă
- Parafilm
- Kimwipes
- Apă deionizată
- Soluția pe care doriți să o testați (cu concentrație necunoscută)
- Soluție standard 1 molar de substanță chimică prezentă în soluția de testare
- Pipetă și bec graduate
- Eprubete și raft pentru eprubete
- Pahar
sfaturi
Această procedură poate părea complicată, dar este de fapt destul de simplă odată ce ați început. Încercați să vizionați cele două videoclipuri din secțiunea Resurse pentru a vă familiariza cu procedura.