Em biologia molecular, uma boa escolha de tampão e preparação para diferentes etapas de isolamento de DNA pode ser a diferença entre passar para a expressão de proteínas ou abrir outro kit maxi-prep para começar sobre. Apesar de sua importância crucial, as receitas de buffer muitas vezes são apenas isso - receitas escritas sem explicação ou justificativa para os diferentes componentes. Um desses tampões é glicose-tris-EDTA ou tampão GTE.
Para que é utilizado o GTE?
GTE é usado para ressuspender pellets de células bacterianas antes de lisar (quebrar) as células e colher o DNA plasmídeo dentro. A lisozima, que amolece as membranas celulares, costuma ser adicionada junto com o tampão GTE. Conseguir uma suspensão homogênea de células inteiras durante esta etapa de modo que a solução de lise subsequentemente adicionada possa chegar a todas as células é a chave para obter bons rendimentos de DNA. O GTE foi projetado para fazer isso e, ao mesmo tempo, fornecer um ambiente estável para o DNA.
Glicose para osmolaridade
Açúcar glicose 50 mM (milimolar) é adicionado ao tampão GTE para manter a osmolaridade onde a concentração de soluto fora das células é próxima à dentro das células. Isso evita a lise celular prematura, que pode causar menores rendimentos de DNA devido à agregação e degradação. Os outros componentes do tampão também contribuem para a osmolaridade da solução, mas a glicose, sendo um não eletrólito, é uma boa escolha porque não interfere com o buffer da solução propriedades.
Tris para estabilidade de pH
Tris é o nome abreviado de tris (hidroximetil) aminometano, que é um tampão de pH muito comum. No caso do tampão GTE, o sal de ácido (Tris-HCl) é adicionado ao tampão a uma concentração de 25 mM. Isso mantém o pH da solução próximo ao fisiológico de 8,0, um pH ideal para prevenir a hidrólise ácida (degradação) do DNA do plasmídeo e reações colaterais indesejadas dos outros componentes da célula.
EDTA impede a degradação do DNA
O EDTA, ou ácido etilenodiaminotetracético, captura ou "quela" os íons metálicos da solução, evitando que participem de reações colaterais indesejadas. No tampão GTE, o EDTA é adicionado a 10 mM. Seu objetivo principal é o tampão para arredondar o zinco, o magnésio e o cálcio livres, evitando assim a degradação do DNA por certas vias que requerem esses metais.
Algumas dicas importantes
Mantenha o tampão GTE frio e prepare-o em pequenas quantidades para evitar o crescimento de bactérias indesejadas nele. O açúcar e o pH controlado são um ótimo meio de crescimento. Sempre use água purificada. A água da torneira pode ter um excesso de íons metálicos dos tubos, o que pode sobrecarregar a capacidade de captura do EDTA. Se você suspeitar da presença de RNA interferente em sua amostra, adicione RNase A a 100 microgramas por mililitro ao seu tampão GTE para eliminar o problema.