De acordo com o site BioWeb da Universidade de Wisconsin, um primer PCR é um oligonucleotídeo sintético curto (geralmente entre 18 até 25 bases de comprimento) usado para amplificar regiões específicas do DNA em uma técnica de biologia molecular conhecida como reação em cadeia da polimerase (PCR). Tanto um primer direto quanto um reverso são necessários, projetados para serem complementos reversos da fita de DNA, para flanquear e se ligar à região de DNA desejada. Quando os cientistas desejam realizar pesquisas sobre um gene ou região específica do DNA, eles primeiro precisam realizar o PCR para adquirir o suficiente da região-alvo para trabalhar. O projeto de sequências de primer para a região de interesse pode ser necessário se elas ainda não estiverem disponíveis por meio de pesquisas publicadas anteriormente ou por meios comerciais.
Obtenha a sequência de nucleotídeos do gene ou região de DNA de interesse e decida por quanto tempo deseja amplificar um fragmento. O primer direto e reverso é projetado para ligar no início e no final do fragmento desejado. Normalmente, os métodos convencionais de PCR usam iniciadores que flanqueiam uma região entre 100 a 1.000 pares de bases de comprimento, enquanto os métodos de PCR em tempo real usam fragmentos de cerca de 50 a 200 pares de bases.
Decida onde na sequência você deseja que os primers fiquem. Por exemplo, você pode querer o local próximo ao final 5 'ou 3' da sequência ou no meio. Se desejado, designe a localização dos primers para abranger um íntron.
Projete os primers com comprimento de 18 a 24 bases. Vincent R. Prezioso, Ph. D., de Brinkmann Instruments Inc., sugere que este comprimento é longo o suficiente para ser extremamente específico para a região de DNA desejada, mas curto o suficiente para ligar (anelar) facilmente. A temperatura de fusão do primer (Tm) deve estar entre 55 a 80 graus Celsius, baixa o suficiente para permitir a fusão completa a ou acima de 90 graus Celsius, mas alta o suficiente para permitir o recozimento. O conteúdo de GC (porcentagem de Gs e Cs na sequência) deve estar entre 40 e 60 por cento. A extremidade 3 'da sequência do iniciador deve terminar em um C ou um G (chamado de garra GC) para promover a ligação, uma vez que o G e C os nucleotídeos têm ligações mais fortes, entretanto, evite ter três ou mais Gs ou Cs nas últimas cinco bases da sequência.
Evite ter corridas de quatro ou mais de uma base (como ACCCC ...) ou quatro ou mais repetições de di-nucleotídeo (como ATATATAT ...) porque eles podem causar falha de primer. Projetar primers sem homologia intra-primer (mais de três bases que se complementam dentro de um próprio iniciador) ou homologia inter-iniciador (onde o iniciador direto e reverso têm complementação sequências). Isso pode causar dímeros próprios ou dímeros primários, onde os primers se ligam a si próprios em vez de se ligarem à sequência de DNA desejada.
Use recursos online e sites que auxiliem no design de primer ou ajudem a verificar sequências de primer para auto-complementaridade ou o potencial de fazer estruturas secundárias como grampos de cabelo. Alguns sites de design de primer incluem o Primer3 do Massachusetts Institute of Technology, o Primer-Blast do National Center for Biotechnology Information e o OligoAnalyzer da Integrated DNA Technologies.