Tris, ou tris (hidroximetil) aminometano, é um tampão biológico comum, usado em todo o processo de extração de DNA. Durante a extração de várias fontes, o DNA é sensível ao pH. Durante a lise celular, remoção de componentes celulares indesejados e precipitação, tris é usado para manter um pH estável. Além disso, desempenha um papel particularmente importante na lise celular.
TL; DR (muito longo; Não li)
A extração de DNA é um processo sensível ao pH e o uso de um tampão tris ajuda a manter o pH estável durante a lise e extração celular.
Tris como um tampão
Como o pH pode influenciar e ser influenciado por vários fatores celulares, manter um pH estável é essencial para a ciência experimental. Tampões biológicos, como o tris, são importantes porque podem manter um pH estável, apesar das influências que poderiam alterar o pH. Tris (hidroximetil) aminometano, com um pKa de 8,1, é um tampão eficaz entre pH 7 e 9. Por causa de sua faixa neutra, o tris é um tampão comumente usado em laboratórios biológicos. No entanto, o tampão tris é sensível à temperatura e deve ser usado na temperatura em que foi originalmente feito o pH para evitar imprecisões.
Lise de células
A lise, ou abertura das células, é a primeira etapa da extração do DNA. Isso é realizado por um tampão contendo tris e EDTA (ácido etilenodiaminotetracético). EDTA liga cátions divalentes, como cálcio e magnésio. Como esses íons ajudam a manter a integridade da membrana celular, eliminá-los com EDTA desestabiliza a membrana. Tris é o principal componente de buffer; seu papel principal é manter o pH do buffer em um ponto estável, geralmente 8,0. Além disso, tris provavelmente interage com o LPS (lipopolissacarídeo) na membrana, servindo para desestabilizar a membrana avançar.
Tris protege o DNA de mudanças de pH
Quando as células se separam, seu DNA e conteúdo se derramam no buffer. Além disso, RNase A (destrói RNA), proteases (destrói proteínas) e SDS (dodecil sulfato de sódio, solubiliza os fragmentos de membrana) são frequentemente incluídos. Em conjunto, essa sopa de conteúdo celular e RNA e proteínas fragmentados podem ter um grande impacto no pH da solução. Como o DNA é sensível ao pH, é importante para o tris tamponar a sopa e manter o pH em um ponto estável.
Precipitação de DNA
Na etapa final da extração do DNA, o próprio DNA é extraído da solução. Neste ponto, o DNA é solúvel no tampão. Para extrair da solução, o DNA se torna insolúvel pela adição de etanol ou isopropanol (álcool isopropílico). Quando isso é feito, o DNA se torna óbvio em solução como uma substância branca e fina. Embora o DNA possa ser isolado dos demais componentes celulares dessa maneira, ele não é "utilizável" quando é insolúvel. Após o isolamento, o álcool é removido e o DNA deve ser devolvido a um tampão biológico, como o tris, para ser usado.
Faça Você Mesmo
Embora a extração de DNA seja comumente feita em laboratórios de pesquisa, geralmente usando um de vários kits disponíveis comercialmente, qualquer pessoa pode fazer extração de DNA em casa usando utensílios domésticos comuns e verdes ervilhas ou espinafre. Neste caso, tris, nem qualquer tampão biológico, não está presente para proteger o DNA de mudanças de pH. No entanto, é uma forma visual de ajudar os alunos a se conectar com o DNA celular.