Como uma amostra de DNA é coletada e preparada para estudo

Antes que eles possam sequenciar o DNA ou alterá-lo por meio da engenharia genética, os cientistas devem primeiro isolá-lo. Isso pode parecer uma tarefa difícil, uma vez que as células contêm uma grande variedade de outros compostos, como proteínas, gorduras, açúcares e pequenas moléculas. Felizmente, os biólogos podem fazer uso das propriedades químicas do DNA para separar o DNA desses contaminantes e prepará-lo para estudos posteriores. Este processo é denominado extração de DNA.

Existem muitas técnicas diferentes utilizadas para a extração de DNA. Aquele usado por um laboratório individual depende do tipo de experimento a ser realizado e quão puro o DNA precisa ser. Os cientistas geralmente começam com uma amostra contendo células - um tecido ou amostra de sangue, por exemplo - e quebram as células, ou as lisam. Existem várias maneiras de lisar células. Adicionar um detergente fará com que eles se separem, e também os sujeitará a ondas sonoras de alta frequência. Alternativamente, misturar a amostra com contas de vidro e vibrá-la rapidamente irá separar fisicamente as células e liberar seu conteúdo.

Se a alta pureza não for necessária, os cientistas podem adicionar uma enzima chamada proteinase K para quebrar a maioria das proteínas na amostra e usá-la como está. Essa técnica é muito suja, entretanto, uma vez que a maioria dos contaminantes ainda está presente, ela só é adequada se a velocidade for uma prioridade e a pureza não for um problema. Outra abordagem rápida e suja é remover as proteínas aumentando a concentração de sal adicionando sais como amônio ou acetato de potássio para forçar a precipitação das proteínas. Essa técnica também é bastante suja, pois muitos outros contaminantes ainda estão presentes.

Outra abordagem é lisar as células com detergente e, em seguida, misturar a solução com álcool isoamílico, clorofórmio e fenol. A solução então se separa em duas camadas. As proteínas acabam na camada orgânica superior, enquanto o DNA permanece na camada aquosa inferior. Esta técnica requer controle cuidadoso da concentração de sal e pH para bons resultados. É demorado e tanto o fenol quanto o clorofórmio são produtos químicos altamente tóxicos. Conseqüentemente, embora as extrações com fenol-clorofórmio já tenham sido rotineiras, outras técnicas se tornaram mais populares nos últimos anos.

A cromatografia de troca aniônica oferece maior pureza e resultados mais consistentes do que a extração com fenol-clorofórmio. Um tubo ou coluna é preenchido com pequenas partículas que possuem locais carregados positivamente onde uma molécula carregada negativamente ou ânion pode se ligar. O DNA se liga a esses locais de troca aniônica, enquanto outros contaminantes, como proteínas e RNA, são eliminados da coluna. Mais tarde, uma solução rica em sal é usada para retirar o DNA da coluna.

A técnica mais rápida e talvez mais confiável para purificar DNA é o uso de um kit especialmente fabricado. Esses kits contêm membranas de sílica gel em um tubo. O DNA adere à membrana enquanto outros contaminantes são removidos por meio de uma série de soluções salinas especialmente preparadas que vêm com o kit. Finalmente, o DNA é removido da coluna com uma solução com baixo teor de sal. Esses kits são rápidos, fáceis de usar e oferecem resultados reproduzíveis.

Uma vez que o DNA foi isolado e ressuspenso em uma solução tampão com pH controlado, a última etapa é testar sua pureza. Uma maneira fácil e conveniente de fazer isso é verificar a quantidade de luz ultravioleta que ele absorve nos comprimentos de onda de 260 e 280 nanômetros. A absorção em 260 nanômetros dividida pela absorção em 280 nanômetros deve ser igual a 1,8 se o DNA for puro. Medir a absorbância a 260 nanômetros também permite determinar a concentração do DNA.