A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) é uma técnica de laboratório usada para separar e identificar compostos. É um tipo de cromatografia em coluna que se baseia em diferentes polaridades de compostos em uma solução para separá-los. HPLC difere da cromatografia de coluna padrão porque usa pressão para forçar a solução através da coluna mais rapidamente e, portanto, produz resultados mais rápidos e às vezes mais precisos. O objetivo é separar os compostos na coluna e fazer com que saiam separadamente.
Devido à velocidade do HPLC e à dependência de diferentes polaridades de compostos, dois compostos com estrutura e polaridades semelhantes podem sair do aparelho de cromatografia ao mesmo tempo ou quase ao mesmo tempo Tempo. Isso é conhecido como coeluição. A coeluição torna difícil determinar exatamente qual porção da mistura eluiu em que ponto.
HPLC normalmente usa uma coluna de vidro cheia de contas feitas de materiais diferentes. As misturas que estão sendo forçadas através da coluna possuem produtos químicos que se ligam com diferentes intensidades aos grânulos. A força da ligação, que depende da similaridade na polaridade, determina por quanto tempo o produto químico se ligará ao cordão antes de ser liberado. Alguns compostos se ligam tão fortemente que essencialmente nunca são liberados dos grânulos na coluna e nunca são medidos na solução que sai da coluna.
As técnicas de separação laboratorial típicas envolvem o desenvolvimento de um ensaio, ou método de separação, e a implementação desse ensaio para separar os compostos individuais de uma solução. No entanto, isso geralmente resulta em várias soluções que também precisam passar por procedimentos, levando a um aumento exponencial da complexidade. Embora a HPLC possa muitas vezes simplificar e acelerar esse processo, o custo de desenvolver um aparelho de HPLC pode se tornar enorme. O desenvolvimento de um aparelho de HPLC, embora muito mais eficiente, é muito mais caro do que o desenvolvimento de outros ensaios para a separação de compostos. Isso o torna financeiramente inviável para muitos pequenos laboratórios privados.
HPLC não é usado apenas para separar compostos simples, também é usado para isolar proteínas específicas de uma mistura celular. Neste caso, as contas na coluna são geralmente revestidas com um anticorpo específico para a proteína que você precisa coletar. As proteínas se ligam aos anticorpos e o restante da solução passa pela coluna, depois as proteínas são liberadas com outra solução e coletadas. Isso requer um técnico altamente qualificado para monitorar a coluna em todos os momentos e certificar-se de que o processo está funcionando exatamente como planejado.
