Klonowanie DNA: definicja, proces, przykłady

Możliwe jest klonowanie całych organizmów, takich jak owca Dolly, ale klonowanie DNA jest inne. Wykorzystuje techniki biologii molekularnej, aby identyczne kopie sekwencji DNA lub pojedyncze geny.

Za pomocą metod inżynierii genetycznej identyfikuje się i izoluje segmenty kodu genetycznego DNA. Klonowanie DNA następnie kopiuje kwasu nukleinowego sekwencje w segmentach.

Powstałe identyczne kopie można wykorzystać do dalszych badań lub do zastosowań biotechnologicznych. Często kopiowany gen koduje białko, które może stanowić część leczenia medycznego. Technologia DNA, w tym Klonowanie DNA wspiera zrozumienie, jak działają geny i jak kod genetyczny człowieka wpływa na funkcjonowanie organizmu.

Klonowanie DNA to proces biologii molekularnej polegający na tworzeniu identycznych kopii segmentów DNA znajdujących się w chromosomach zawierających kod genetyczny zaawansowanych organizmów.

Proces generuje duże ilości docelowe sekwencje DNA. Celem klonowania DNA jest wytworzenie samych docelowych sekwencji DNA lub wytworzenie białek zakodowanych w docelowych sekwencjach.

Dwie metody stosowane w klonowaniu DNA to wektor plazmidowy i łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR). w wektor plazmidowy metoda, nici DNA są cięte za pomocą Enzymy restrykcyjne w celu wytworzenia fragmentów DNA, a powstałe segmenty wstawia się do wektorów klonujących zwanych plazmidami w celu dalszej duplikacji. Plazmidy umieszcza się w komórkach bakteryjnych, które następnie wytwarzają kopie DNA lub kodowane białka.

w Metoda PCR, odcinek nici DNA, który ma zostać zduplikowany, jest oznaczony enzymami zwanymi podkłady. Enzym polimerazy tworzy kopie zaznaczonej części nici DNA. Ta metoda nie wykorzystuje enzymów restrykcyjnych i może wytwarzać sklonowane DNA z małych próbek. Czasami dwie metody technologii DNA są używane razem, aby włączyć najlepsze cechy każdej z nich do ogólnej reakcji.

Wektor metody odnosi się do plazmidu stosowanego do przechowywania docelowego segmentu DNA, który ma być sklonowany. Plazmidy to małe okrągłe pasma niechromosomalny DNA występują w wielu organizmach, w tym bakteriach i wirusach.

Plazmidy bakteryjne są wektorami używanymi do wstawiania docelowego segmentu DNA do komórek bakteryjnych w celu dalszej duplikacji.

Wybór i izolowanie docelowego DNA: Zanim rozpocznie się proces klonowania DNA, należy zidentyfikować sekwencje DNA, zwłaszcza początki i końce segmentów DNA.

Takie sekwencje DNA można znaleźć przy użyciu istniejącego sklonowanego DNA o znanych sekwencjach lub przez badanie białka wytwarzanego przez docelową sekwencję DNA. Gdy sekwencja jest znana, można zastosować odpowiednie enzymy restrykcyjne.

Cięcie docelowego DNA enzymami restrykcyjnymi: Enzymy restrykcyjne są wybierane w celu wyszukania kodu DNA na początku i na końcu sekwencji docelowych.

Kiedy enzymy restrykcyjne znajdą specjalnie zakodowaną sekwencję par zasad zwanych miejscami restrykcyjnymi, przyczepiają się do DNA w tym miejscu i owijają się wokół cząsteczki DNA, odcinając pasmo. Wycięte segmenty DNA zawierające sekwencję docelową są teraz dostępne do duplikacji.

Wybór wektora plazmidowego i wstawienie docelowego DNA: Idealnie odpowiedni plazmid zawiera te same sekwencje kodujące DNA, co nić DNA, z której wycięto docelowy DNA. Okrągła nić DNA plazmidu jest cięta tymi samymi enzymami restrykcyjnymi, jakie zastosowano do cięcia docelowego DNA.

ZA Enzym ligazy DNA służy do promowania łączenia segmentów DNA, a końce docelowego segmentu DNA łączą się z odciętymi końcami plazmidowego DNA. Docelowy DNA tworzy teraz część okrągłej nici plazmidowego DNA.

Wprowadzenie plazmidu do komórki bakteryjnej: Gdy plazmid zawiera sekwencję DNA do sklonowania, faktyczne klonowanie może odbyć się za pomocą procesu zwanego transformacja bakteryjna. Plazmidy są wstawiane do komórki bakteryjnej, takiej jak E. coli, a komórki z nowymi segmentami DNA zaczną wytwarzać kopie i odpowiadające im białka.

W transformacji bakteryjnej komórki gospodarza i plazmidy inkubuje się razem w temperaturze ciała przez około 12 godzin. Komórki absorbują część plazmidów i traktują je jako własne plazmidowe DNA.

Zbieranie sklonowanego DNA i białek: Większość plazmidów używanych do klonowania DNA ma geny oporności na antybiotyki włączone do ich DNA. Gdy komórki bakteryjne absorbują nowe plazmidy, stają się odporne na antybiotyki.

Kiedy kultura jest traktowana antybiotykami, przeżywają tylko te komórki, które wchłonęły nowe plazmidy. Rezultatem jest czysta kultura komórek bakteryjnych ze sklonowanym DNA. To DNA można następnie zebrać lub wytworzyć odpowiednie białko.

PCR metoda jest prostsza i kopiuje istniejący DNA w miejscu. Nie wymaga cięcia enzymami restrykcyjnymi ani wkładania plazmidDNA sekwencje. Dzięki temu jest szczególnie odpowiedni do klonowania próbek DNA z ograniczoną liczbą nici DNA. Chociaż metoda może klonować DNA, nie można jej użyć do produkcji odpowiedniego białka.

Rozwijanie nici DNA: DNA w chromosomach jest ciasno zwinięte w strukturę podwójnej helisy. Podgrzewanie DNA do 96 stopni Celsjusza w procesie zwanym denaturacja sprawia, że ​​cząsteczka DNA rozwija się i rozdziela na dwie nici. Ten rozdział jest wymagany, ponieważ w jednym czasie można sklonować tylko jedną nić DNA.

Dobór podkładów: Podobnie jak w przypadku klonowania plazmidowego wektora DNA, sekwencje DNA do klonowania muszą być zidentyfikowane ze szczególnym naciskiem na początki i końce segmentów DNA. Startery to enzymy, które przyłączają się do określonych sekwencji kodu DNA i muszą być dobrane w celu oznaczenia docelowych segmentów DNA. Właściwe startery przyłączą się do sekwencji cząsteczki DNA, aby zaznaczyć początki i końce segmentów docelowych.

Wyżarzanie reakcji w celu związania podkładów: Nazywa się schłodzenie reakcji do około 55 stopni Celsjusza wyżarzanie. Gdy reakcja stygnie, startery są aktywowane i przyczepiają się do nici DNA na każdym końcu docelowego segmentu DNA. Startery działają jedynie jako markery, a nić DNA nie musi być przecięta.

Wytwarzanie identycznych kopii docelowego segmentu DNA: W procesie zwanym rozbudowa, do reakcji dodaje się wrażliwy na ciepło enzym polimerazę TAQ. Reakcję następnie ogrzewa się do 72 stopni Celsjusza, aktywując enzym. Aktywny enzym polimeraza DNA wiąże się ze starterami i kopiuje między nimi sekwencję DNA. Początkowy proces sekwencjonowania i klonowania DNA jest zakończony.

Zwiększenie wydajności klonowanego DNA: Wstępny proces przyłączania i wydłużania tworzy stosunkowo niewiele kopii dostępnych segmentów nici DNA. Aby zwiększyć wydajność poprzez dodatkową replikację DNA, reakcję ponownie chłodzi się, aby ponownie aktywować startery i pozwolić im związać się z innymi niciami DNA.

Następnie ponowne podgrzanie reakcji ponownie aktywuje enzym polimerazę i powstaje więcej kopii. Ten cykl można powtórzyć od 25 do 30 razy.

Metoda wektora plazmidowego opiera się na wystarczającym początkowym podaniu DNA do cięcia i wstawiania do plazmidów. Zbyt mało oryginalnego DNA skutkuje mniejszą liczbą plazmidów i powolnym początkiem produkcji klonowanego DNA.

Metoda PCR może wytworzyć dużą ilość DNA z kilku oryginalnych nici DNA, ale ponieważ DNA nie jest wszczepione do komórki bakteryjnej, produkcja białka nie jest możliwa.

Aby wytworzyć białko kodowane we fragmentach DNA, które mają być sklonowane z małej początkowej próbki DNA, obie metody mogą być stosowane razem i mogą wzajemnie się uzupełniają. Najpierw metoda PCR służy do klonowania DNA z małej próbki i wytworzenia wielu kopii.

Następnie produkty PCR wykorzystuje się metodą wektora plazmidowego do implantacji wytworzonego DNA do komórek bakteryjnych, które wytworzą pożądane białko.

Biologia molekularna wykorzystuje klonowanie genów i replikację DNA do celów medycznych i komercyjnych. Bakterie ze sklonowanymi sekwencjami DNA są wykorzystywane do produkcji leków i zastępowania substancji, których osoby z zaburzeniami genetycznymi nie są w stanie samodzielnie wytworzyć.

Typowe zastosowania obejmują:

• Gen dla insulina ludzka jest klonowany w bakteriach, które następnie produkują insulinę stosowaną przez diabetyków.
• Aktywator plazminogenu tkankowego jest wytwarzany ze sklonowanego DNA i używany do pomocy zapobiegać zakrzepom krwi.
• Ludzki hormon wzrostu mogą być produkowane i podawane ludziom, którzy sami nie potrafią tego wyprodukować.

Biotechnologia wykorzystuje również klonowanie genów w rolnictwie do tworzenia nowych cech roślin i zwierząt lub wzmacniania istniejących cech. W miarę klonowania większej liczby genów liczba możliwych zastosowań rośnie wykładniczo.

Cząsteczki DNA stanowią niewielką część materiału w żywej komórce i trudno jest wyizolować wpływy wielu genów. Metody klonowania DNA dostarczają duże ilości określonej sekwencji DNA do badania, a DNA wytwarza białka tak samo, jak w oryginalnej komórce. Klonowanie DNA umożliwia badanie tej operacji dla różnych genów w izolacji.

Typowe zastosowania badań i technologii DNA obejmują badanie:

• Funkcja genu.
• Mutacje genu.
• Ekspresja genu.
• Produkty genów.
• Wady genetyczne.

Gdy sklonuje się więcej sekwencji DNA, łatwiej jest znaleźć i sklonować dodatkowe sekwencje. Istniejące sklonowane segmenty DNA można wykorzystać do określenia, czy nowy segment pasuje do starego i które części są inne. Identyfikacja docelowej sekwencji DNA jest wtedy szybsza i dokładniejsza.

W Terapia genowasklonowany gen jest prezentowany komórkom organizmu, którego naturalny gen jest uszkodzony. Niezbędny do życia gen, który wytwarza białko wymagane do określonej funkcji organizmu, może zostać zmutowany, zmieniony przez promieniowanie lub dotknięty wirusami.

Kiedy gen nie działa prawidłowo, w komórce brakuje ważnej substancji. Terapia genowa stara się zastąp gen sklonowaną wersją, która wytworzy wymaganą substancję.

Terapia genowa jest nadal eksperymentalna i niewielu pacjentów zostało wyleczonych przy użyciu tej techniki. Problemy polegają na zidentyfikowaniu pojedynczego genu odpowiedzialnego za stan chorobowy i dostarczeniu wielu kopii genu do właściwych komórek. Ponieważ klonowanie DNA stało się coraz bardziej rozpowszechnione, terapię genową zastosowano w kilku konkretnych sytuacjach.

Ostatnie udane aplikacje obejmowały:

• Choroba Parkinsona: Używając wirusa jako wektora, gen związany z chorobą Parkinsona został wstrzyknięty do śródmózgowia pacjentów. Pacjenci doświadczyli poprawy zdolności motorycznych bez żadnych niepożądanych skutków ubocznych.
• Niedobór deaminazy adenozynowej (ADA): Genetyczne zaburzenie odporności zostało wyleczone poprzez usunięcie komórek macierzystych krwi pacjentów i wprowadzenie genu ADA. W rezultacie pacjenci byli w stanie wytworzyć przynajmniej część własnych ADA.
• Hemofilia: Osoby z hemofilią nie wytwarzają specyficznych białek, które pomagają w krzepnięciu krwi. Do komórek wątroby pacjentów wprowadzono gen do produkcji jednego z brakujących białek. Pacjenci wytwarzali białko, a incydenty krwawień zostały zmniejszone.

Terapia genowa jest jednym z najbardziej obiecujących zastosowań klonowania DNA, ale wraz z badaniem większej liczby sekwencji DNA i określeniem ich funkcji prawdopodobnie pojawią się inne nowe zastosowania. Klonowanie DNA dostarcza surowca do inżynierii genetycznej w wymaganych ilościach.

Gdy rola genów jest znana, a ich właściwą funkcję można zapewnić poprzez zastępowanie wadliwych geny, wiele chorób przewlekłych, a nawet raka, można zaatakować i leczyć na poziomie genetycznym przy użyciu DNA technologia.

Powiązana zawartość:

• Charakterystyka kolonii E.Coli (Escherichia Coli)
• RNA: definicja, funkcja, struktura