Elektroforeza żelowa to powszechnie stosowana technika laboratoryjna mająca wiele praktycznych zastosowań, w tym odciski palców DNA i sekwencjonowanie genomu. Proces obejmuje oddzielenie DNA fragmenty za pomocą prądu elektrycznego, śledząc szybkość ruchu cząsteczek przez żel filtrujący.
Dodanie niebieskiego lub pomarańczowego barwnika śledzącego do bezbarwnych próbek DNA pozwala zobaczyć próbkę i uzyskać informacje o tym, jak cząsteczki DNA poruszają się podczas elektroforezy. Identyfikacja opiera się na wielkości prążków DNA na żelu po migracji cząsteczek.
Jak działa elektroforeza żelowa
Elektroforeza żelowa przeciąga fragmenty DNA przez żel za pomocą prądu elektrycznego, aby izolować i identyfikować cząsteczki DNA według wielkości i ładunku elektrycznego. Żel jest często wytwarzany z proszek agarozy — polisacharyd wyekstrahowany z wodorost.
Agarozę dodaje się do roztworu buforowego wody i soli, a mieszaninę ogrzewa się i chłodzi, aby uzyskać porowaty żel, który będzie działał jako matryca filtrująca podczas procedury elektroforezy. Żel jest następnie umieszczany w jednostce do elektroforezy i pokryty roztworem buforowym, który przewodzi
Elektryczność.Roztwory zawierające DNA i barwniki obciążające są pipetowane do małych dołków w żelu, które należy przygotować podczas przygotowywania żelu. Barwnikipomóc Ciwyraźnie zobaczyć próbkę że dodajesz do dołków żelu znajdujących się w pobliżu elektrody ujemnej jednostki do elektroforezy.
Na przeciwległym końcu znajduje się elektroda dodatnia. Znany standard fragmentów DNA umieszcza się w pierwszej studzience, która utworzy drabinkę prążków DNA do celów porównawczych i identyfikacyjnych.
Szkielet fosforanowy cząsteczek DNA nadaje DNA ładunek ujemny. Przeciwieństwa się przyciągają, w konsekwencji cząsteczki DNA są przyciągane do elektrody dodatniej i zaczynają się poruszać lub „migrować”, gdy włączony jest prąd elektryczny.
Fragmenty DNA o mniejszych rozmiarach podróżują szybciej niż większe fragmenty, ponieważ napotykają mniejszy opór podczas migracji przez porowatą macierz żelu. Fragmenty DNA o podobnej wielkości tworzą pasma DNA w żelu.
Ładowanie celu i znaczenia barwnika
DNA jest bezbarwne, więc dodając barwniki śledzące do próbki pomaga określić szybkość ruchu cząsteczek białka o różnej wielkości w żelu podczas elektroforezy. Przykłady ładowania barwników, które poruszają się z próbką DNA obejmują bromofenolniebieski i cyjano ksylenu.
Wybrany barwnik nie powinien być reaktywny ani zmieniać DNA. Błękit bromofenolowy jest barwnikiem używanym do śledzenia mniejszych nici DNA zawierających około 400 par zasad, podczas gdy cyjanocyjan ksylenu jest lepszy w przypadku większych nici DNA zawierających do 8000 par zasad. Wybrany barwnik nie powinien być reaktywny ani zmieniać DNA.
Rola glicerolu w elektroforezie w żelu agarozowym
Podczas przygotowywania próbki DNA do elektroforeza, będziesz musiał dodać glicerynę i wodę wraz z barwnikami ładującymi. Glicerol jest ciężką, syropowatą substancją, która zapewnia większą gęstość próbki DNA przed jej wprowadzeniem do dołków na jednym końcu arkusza żelowego.
Bez glicerolu próbka DNA rozproszyłaby się zamiast opadać i tworzyć warstwę w studni, tak jak powinna, aby utworzyć drabinę DNA.
Barwnik śledzący na SDS PAGE
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS PAGE) to technika odpowiednia do oddzielania białek i aminokwasów, które są mniejsze i bardziej złożone niż liniowe cząsteczki DNA. Do elektroforezy zamiast żelu agarozowego stosuje się poliakrylamid (żel SDS PAGE).
Błękit bromofenolowy (BPB) jest dodawany do buforu próbki jako barwnik śledzący który porusza się w tym samym kierunku co oddzielanie białek i wyznacza ich czołową krawędź.
Rola barwnika wiążącego DNA
Barwnik wiążący DNA, taki jak pomarańczowy kolor bromek etydyny można dodać do żelu lub do buforu do elektroforezy. Jak sama nazwa wskazuje, barwnik przyłącza się do cząsteczki DNA.
Należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z tym mutagennym barwnikiem, ponieważ może on wiązać się z DNA w komórkach skóry. W przeciwieństwie do barwników śledzących bromek etydyny fluoryzuje jasno pod światło ultrafioletowe, dzięki czemu widoczne są prążki DNA.
